[發明專利]一種隱孢子蟲蛋白激酶的純化方法

有效

• 申請號: 201811497728.4
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109735513B
• 公開（公告）日: 2023-09-01
• 發明（設計）人: 馮耀宇;蘇嘉緣;張強;李娜;郭亞瓊
• 申請（專利權）人: 華東理工大學;華南農業大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

1.?一種隱孢子蟲蛋白激酶的純化方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.制備誘導表達蛋白

S11.構建含隱孢子蟲蛋白激酶基因的原核表達載體；

S12.將S11的原核表達載體轉入表達宿主菌，挑取陽性克隆菌，保存；

S13.將S12挑取的陽性克隆菌經擴大培養至對數生長期后進行誘導表達；

S14.取S13誘導表達后的菌液，冷凍離心收集菌體，棄上清，重懸菌體，然后冰浴超聲裂解菌體；

S15.取S14所得裂解液，冷凍離心分上清和沉淀；

對于可溶性蛋白，取上清直接進行后續實驗；

對于不可溶蛋白，將沉淀經尿素洗滌、溶解后，低溫離心，取上清；

S16.取步驟S15中所得上清溶液用0?.45μm的濾膜進行過濾，然后與Ni柱在冰上孵育后，反復上柱若干次，然后經洗滌液充分洗滌后，用5倍柱體積的洗脫液收集目的蛋白；

S2.割膠回收純化蛋白

S21.取S16所得蛋白溶液進行蛋白電泳，進行蛋白電泳時，蛋白樣品不經煮沸處理；過程在冰上進行；電泳后蛋白膠經KCl溶液染色5～10?min；顯影結束后根據蛋白Marker在目的蛋白大小處切下乳白色蛋白條帶，經去離子水水洗浸泡至無色；所述KCl溶液的濃度為0.25?M，溫度為4℃；

S22.將S21中所得蛋白條帶放入透析袋中，將透析袋浸潤在緩沖液中，并進行電泳30～60?min，再調換電極，繼續電泳2～3min；其中電泳為兩次正反電泳其條件均為4℃，恒壓100V；

S23.將S22透析袋中所得蛋白溶液收集并放入新的透析袋中，更換浸潤用緩沖液，再次透析，得到純化后的隱孢子蟲蛋白激酶；

所述隱孢子蟲蛋白激酶為CpCDPK1或CpCDPK9，所述CpCDPK1基因序列如SEQ?ID?NO：3所示，CpCDPK9基因序列如SEQ?ID?NO：6所示。

2.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，S11所述原核表達載體為pET-28a，S12所述表達宿主菌為大腸桿菌BL21。

3.?根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，S13中擴大培養步驟中菌體接種量為1%，誘導初始時菌體OD600值在0?.6～0?.8之間，誘導表達的條件為終濃度0?.2～0?.4mM的IPTG，16～25℃，150?~200?rpm誘導4～6?h。

4.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，步驟S15中，對于不可溶蛋白，若尿素溶解液不掛柱，可采用梯度尿素洗脫的方法代替后續上柱洗脫步驟，具體步驟如下：

將沉淀用2?M尿素溶液重懸，搖床孵育2h后，12000?rpm，30?min，棄上清，收集沉淀；

將收集得到的沉淀繼續用4?M尿素溶液重懸，搖床孵育2h后，12000?rpm，

30?min，棄上清，收集沉淀；

將收集得到的沉淀繼續用6?M尿素溶液重懸，搖床孵育2h后，12000?rpm，

30?min，棄上清，收集沉淀；

最后將沉淀用8?M尿素重懸，搖床孵育過夜，12000?rpm，30?min，收集上清，進行跑膠驗證。

5.根據權利要求1所述的純化方法，其特征在于，S23中蛋白溶液與緩沖液的體積比為1：15～25。