[發明專利]一種山羊環狀RNA circ_ZCCHC2及其鑒定方法及應用

有效

• 申請號: 201811495213.0
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109609656B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 陶虎;陳明新;劉洋;熊琪;李曉鋒;索效軍;張年;楊前平;田宏;張鶴山;熊軍波;張鳳
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/113
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 黃君軍

1.一種山羊環狀RNA circ_ZCCHC24的鑒定方法，其特征在于：所述山羊環狀RNAcirc_ZCCHC24的核苷酸序列如后附序列表SEQ ID NO:1所示，其鑒定方法包括以下步驟：

步驟一：采集山羊的腎、心、肌肉、肝、脾、卵泡和肺組織樣本放入液氮帶回實驗室，采用組織RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，并檢測其濃度與質量，作為待檢測樣品；

步驟二：將上述步驟一中的RNA通過反轉錄試劑盒進行逆轉錄獲得cDNA；

步驟三：利用上游引物PF1和下游引物PR1對步驟二中獲得的待檢測樣品通過實時熒光定量qRT-PCR技術進行序列擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物的序列長度，再經由Sanger測序技術，獲得接頭序列的真實堿基信息，與山羊環狀RNA circ_ZCCHC24的接頭序列進行比對，如果序列信息一致，則能夠證明山羊環狀RNA circ_ZCCHC24是真正成環的RNA；

步驟四：利用上游引物PF1和下游引物PR1和步驟二中獲得的cDNA，通過實時熒光定量qRT-PCR技術，對不同組織樣本中的山羊環狀RNA circ_ZCCHC24進行相對定量分析，取得的數據采用2^-ΔΔCT法計算并獲得不同組織樣本中山羊環狀RNA circ_ZCCHC24的相對表達量，根據不同組織樣本中山羊環狀RNA circ_ZCCHC24的相對表達量判斷待測樣本是否存在該環狀RNA及其表達水平；

所述上游引物PF1的序列：TGTGCTTCAACAAAGGGCACTA，見序列表SEQ ID NO:2；

所述下游引物PR1的序列：TTCTCTCTCGTGTAGGCTTGGA，見序列表SEQ ID NO:3；

所述山羊環狀RNA circ_ZCCHC24的接頭序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。

2.根據權利要求1所述的一種山羊環狀RNA circ_ZCCHC24的鑒定方法，其特征在于：所述步驟一中的待檢測樣品RNA提取過程為：采用RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，并檢測其濃度與質量，所述步驟二中逆轉錄獲得cDNA的具體實施方法為：采集山羊不同組織樣本，提取RNA后利用反轉錄試劑盒合成cDNA，所述步驟三中的實時熒光定量qRT-PCR反應體系如下：SYBR Green Supermix 10uL,上游引物0.25uL，下游引物0.25uL，待檢測cDNA模板0.5uL，ddH₂O 9uL，總體系為20uL，所述步驟四中的實時熒光定量qRT-PCR反應條件為：94℃，3min；94℃，10s，60℃，10s，72℃，30s，40個循環；95℃，10s，62℃，60s，97℃，1s，1個循環。

3.一種山羊環狀RNAcirc_ZCCHC24超表達載體在培育高繁殖力山羊品種中的應用，其特征在于：所述山羊環狀RNA circ_ZCCHC24的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：山羊環狀RNAcirc_ZCCHC24超表達載體為pCD2.1-circ_ZCCHC24，包括環狀RNA超表達載體pCD2.1-ciR和山羊環狀RNAcirc_ZCCHC24的全長序列。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：所述pCD2.1-circ_ZCCHC24超表達載體的構建過程為：將環狀RNA circ_ZCCHC24的全長序列片段，整合到環狀RNA超表達載體pCD2.1-ciR中，得到所述山羊環狀pCD2.1-circ_ZCCHC24超表達載體。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：所述pCD2.1-circ_ZCCHC24超表達載體的構建過程中還包括進行circ_ZCCHC24的全長序列片段的PCR擴增的上游引物PF2和下游引物PR2，上游引物PF2核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物PR2核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。