[發明專利]黃曲霉毒素產量與Nor-1基因轉錄量的同步檢測RT-PCR試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201811494322.0
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109468367B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 李培武;李慧;張奇;唐曉倩;白藝珍;張文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇;徐曉琴

本發明屬于生物領域，具體涉及一種黃曲霉毒素產量與Nor?1基因轉錄量的同步檢測RT?PCR試劑盒及其檢測方法。本發明建立了同步檢測黃曲霉菌株產毒量和nor?1基因轉錄量的同步RT?PCR檢測方法，利用所述方法檢測所得黃曲霉菌株產毒量、nor?1基因轉錄量與采用HPLC定量黃曲霉毒素、Nanodrop定量Nor?1基因轉錄量的結果存在良好的線性關系，因此，基于同步檢測RT?PCR方法獲得的AFT/Nor?1的比值結果可靠、準確，可以作為判定黃曲霉菌株產毒力高低的鑒定指標，實現了對黃曲霉菌株產毒力的快速、準確的鑒定評價，對黃曲霉毒素污染預警與防控具有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物領域，具體涉及一種黃曲霉毒素產量與Nor-1基因轉錄量的同步檢測RT-PCR試劑盒及其檢測方法。

背景技術

黃曲霉毒素是迄今發現毒性最強的一類真菌毒素，以黃曲霉毒素B1為例，其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，被國際癌癥組織列為I類致癌物。黃曲霉毒素極易污染花生、玉米、稻米等糧油作物產品，還污染核桃、開心果以及中藥材等眾多植物產品。國內外發生過多起黃曲霉毒素引發的人畜群體中毒事件。據國際癌癥研究署(IARC)最新報道，全球僅發展中國家就有約5億人口飽受黃曲霉毒素暴露風險。我國是黃曲霉毒素污染較重地區。農業部多年普查結果表明，我國主要農作物產品受黃曲霉毒素污染呈持續加重趨勢，嚴重地區毒素含量超過限量標準的數百倍；雖然強產毒菌株占比不到20％，但卻已成為威脅農作物產品質量安全的重大隱患。

黃曲霉毒素主要由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產生。已有研究表明，不同黃曲霉菌株產生黃曲霉毒素的能力——即產毒力可相差數百倍，強產毒菌株是造成高污染的重要源頭，但至今缺乏特異性快速鑒別強產毒菌株的有效方法。目前鑒別黃曲霉菌株產毒力的方法主要有兩類：一類是培養菌株一定時間后直接通過測定其產生黃曲霉毒素的量來評價其產毒能力。這類方法一是時間長，必須首先分離出菌株，再培養，最后通過檢測黃曲霉毒素含量進行評價；二是黃曲霉毒素的生物合成受影響因素非常多且復雜，同一菌株培養不同培養批次之間的黃曲霉毒素產量差異大，結果難以用作表征菌株本應恒定的自身產毒特性，從而影響該方法鑒別評價結果的準確可靠性。另一類方法是通過測定產毒相關基因轉錄水平來評價菌株產毒力，有文獻報道檢測Nor-1基因評價產毒力。但是，這類方法的不足之處在于：自然狀態下就有至少約20％的菌株因檢測基因以外的產毒相關基因的缺失導致天然不產毒，但檢測基因仍可表達，從而導致這類方法的假性結果。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，目的在于提供一種黃曲霉毒素產量與Nor-1基因轉錄量的同步檢測RT-PCR試劑盒及其檢測方法。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種黃曲霉毒素產量與Nor-1基因轉錄量同步檢測RT-PCR試劑盒，包括：

1)用于擴增表面展示黃曲霉毒素抗獨特型納米抗體的噬菌體所釋放DNA片段的引物和探針：上游引物Ph-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物Ph-R，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；熒光探針Ph-probe，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

2)用于擴增Tq-nor-1基因的引物和探針：上游引物Tq-nor1-F，核苷酸序列如SEQID NO.4所示；下游引物Tq-nor1-R，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；熒光探針Tq-probe，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

3)通用型探針qPCR預混液、DNA聚合酶、MgCl₂、dNTPs、H₂O。

按上述方案，所述上下游引物：Ph-F、Ph-R、Tq-nor1-F、Tq-nor1-R在PT-PCR擴增反應體系中的終濃度均為300～400nM。

按上述方案，所述熒光探針：Ph-probe和Tq-probe在PT-PCR擴增反應體系中的終濃度均為200～400nM。