[發(fā)明專利]黃曲霉毒素產(chǎn)量與Nor-1基因轉(zhuǎn)錄量的同步檢測RT-PCR試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811494322.0
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109468367B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李培武;李慧;張奇;唐曉倩;白藝珍;張文
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇;徐曉琴

1.一種黃曲霉毒素產(chǎn)量與Nor-1基因轉(zhuǎn)錄量同步檢測RT-PCR試劑盒，其特征在于，包括：

1)用于擴增表面展示黃曲霉毒素抗獨特型納米抗體的噬菌體所釋放DNA片段的引物和探針：上游引物Ph-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物Ph-R，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；熒光探針Ph-probe，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；和，

2)用于擴增Tq-nor-1基因的引物和探針：上游引物Tq-nor1-F，核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；下游引物Tq-nor1-R，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；熒光探針Tq-probe，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；和，

3)通用型探針qPCR預(yù)混液、DNA聚合酶、MgCl₂、dNTPs、H₂O。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述黃曲霉毒素產(chǎn)量與Nor-1基因轉(zhuǎn)錄量同步檢測RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述上下游引物：Ph-F、Ph-R、Tq-nor1-F、Tq-nor1-R在RT-PCR擴增反應(yīng)體系中的終濃度均為300～400nM。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述黃曲霉毒素產(chǎn)量與Nor-1基因轉(zhuǎn)錄量同步檢測RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述熒光探針：Ph-probe和Tq-probe在RT-PCR擴增反應(yīng)體系中的終濃度均為200～400nM。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述黃曲霉毒素產(chǎn)量與Nor-1基因轉(zhuǎn)錄量同步檢測RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶在RT-PCR擴增反應(yīng)體系中最終用量為0.5U～1.0U，所述MgCl₂在RT-PCR擴增反應(yīng)體系中的終濃度為1mM～2mM，所述dNTPs在RT-PCR擴增反應(yīng)體系中的終濃度為200uM～400uM。

5.利用權(quán)利要求1～4任一所述試劑盒同步RT-PCR檢測黃曲霉毒素產(chǎn)量與Nor-1基因轉(zhuǎn)錄量的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)黃曲霉毒素定量S型標準曲線的建立：免疫競爭反應(yīng)階段，在黃曲霉毒素單克隆抗體包被量一定的情況下，采用不同濃度的黃曲霉毒素標品與表面展示黃曲霉毒素抗獨特型納米抗體的噬菌體競爭結(jié)合黃曲霉毒素單克隆抗體，免疫競爭反應(yīng)結(jié)束后，將結(jié)合在黃曲霉毒素單克隆抗體上的表面展示黃曲霉毒素抗獨特型納米抗體的噬菌體洗脫，不同濃度的黃曲霉毒素標品對應(yīng)洗脫不同量的表面展示黃曲霉毒素抗獨特型納米抗體的噬菌體，洗脫液中的噬菌體在PCR加熱的過程中會釋放DNA分子，釋放的DNA分子作為RT-PCR反應(yīng)中的擴增靶標，采用所述試劑盒將各洗脫液分別進行同步RT-PCR擴增反應(yīng)，擴增反應(yīng)結(jié)束后獲得不同的Ct值，以黃曲霉毒素濃度的對數(shù)值為橫坐標，以Ct值為縱坐標，進行回歸分析，得到黃曲霉毒素的定量S型標準曲線；

(2)Nor-1基因轉(zhuǎn)錄量RT-PCR標準曲線的建立：將nor-1基因DNA片段Tq-nor1已知拷貝數(shù)的樣本連續(xù)稀釋成不同拷貝數(shù)，然后采用所述試劑盒對各拷貝數(shù)Tq-nor1分別進行同步RT-PCR擴增反應(yīng)，擴增反應(yīng)結(jié)束后獲得不同的Ct值，以Tq-nor1拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以Ct值為縱坐標，進行回歸分析，得到nor-1基因轉(zhuǎn)錄量的定量標準曲線；

(3)培養(yǎng)黃曲霉菌株，取黃曲霉菌孢子進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，過濾取菌株培養(yǎng)液和黃曲霉菌絲球；將菌株培養(yǎng)液稀釋一定倍數(shù)后，替代步驟(1)所述免疫反應(yīng)中的黃曲霉毒素標品參與免疫競爭反應(yīng)，免疫競爭反應(yīng)后將結(jié)合在黃曲霉毒素單克隆抗體上的表面展示黃曲霉毒素抗獨特型納米抗體的噬菌體洗脫，將洗脫液中噬菌體釋放的DNA分子作為同步RT-PCR擴增反應(yīng)中定量擴增黃曲霉毒素的模板；另將黃曲霉菌絲球干燥后，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將該cDNA稀釋一定倍數(shù)后作為同步RT-PCR擴增反應(yīng)中定量擴增Nor-1基因的模板；

(4)以所述噬菌體釋放的DNA分子和所述cDNA為模板進行同步RT-PCR擴增反應(yīng)，擴增反應(yīng)結(jié)束后獲得兩個Ct值，將兩個Ct值分別代入黃曲霉毒素的定量S型標準曲線和nor-1基因轉(zhuǎn)錄量的定量標準曲線，換算得到黃曲霉毒素濃度和nor-1基因轉(zhuǎn)錄量，以此確定黃曲霉毒素產(chǎn)量與Nor-1基因轉(zhuǎn)錄量的比值。