[發明專利]海藻原生質體分離培養和再生植株的方法

有效

• 申請號: 201811494026.0
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109511550B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 王斌;張建設;楊靜靜
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京國翰知識產權代理事務所(普通合伙) 11696
• 代理人: 衛翠婷

本發明提供海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，屬于藻類培養領域，具體方法為：選擇顏色正常、無腐爛、生長旺盛的藻體，用毛刷清理藻體表面污泥、雜藻和其它附屬雜質，用HgCl₂溶液消毒，接著使用消毒海水沖洗干凈，切取新鮮藻體頂端幼嫩部分，用濾紙吸干表面水分，將其剪切或研磨成細小的組織塊或小的分枝，先在酒石酸鉀鈉和聚乙烯吡咯烷酮混合溶液中浸泡，再利用海藻工具酶溶液進行消化酶解，然后經離心沉淀，獲得海藻體細胞原生質；將原生質體培養得到再生細胞壁的細胞，進一步培養即可得到再生植株。本發明提供一種育苗周期短、苗種繁育效率高的海藻的培養方法，它能夠解決無性生殖類海藻苗種保種和繁育的問題，可用于生產性育苗。

技術領域

本發明屬于藻類培養方法領域，具體涉及海藻原生質體分離培養和再生植株的方法。

背景技術

藻類雖無花、果、種子等構造來繁衍后代，卻有各式各樣的生殖方式來適應環境。在無性生殖方面，有些細胞可以直接一分為二，如水綿，可以斷成數段，每段再各自成長為獨立個體；有的藻體可以產生許多有鞭毛的孢子，可自由游動，每一孢子成熟后各自長成為一新的個體；在環境不良時，有些藻類可產生厚壁的休眠孢子，等環境適宜時，再萌芽生長成新的個體。在有性生殖方面，有些藻類可產生雌、雄配子，經由交配后才長成新的個體。

現有公開號為CN 102144544 A的中國發明專利，公開了一種麒麟菜屬海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，其主要是根據海藻體細胞發育的全能性，利用海藻工具酶分解麒麟菜組織，游離出體細胞原生質體，獲得再生細胞壁的體細胞和細胞系，然后將其培養得到再生植株；然而，該發明酶解效率低，且原生質體培養條件粗略，不利于提高苗種繁育效率。

發明內容

本發明的目的在于提供海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，提供一種育苗周期短、苗種繁育效率高的海藻的培養方法，它能夠解決無性生殖類海藻苗種保種和繁育的問題，可用于生產性育苗。

本發明為實現上述目的所采取的技術方案為：

海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，主要是根據海藻體細胞發育的全能性，利用海藻工具酶分解海藻組織，游離出體細胞原生質體，獲得再生細胞壁的體細胞和細胞系，然后將其培養得到再生植株。具體步驟如下：

步驟一、選擇顏色正常、無腐爛、生長旺盛的藻體，用毛刷清理藻體表面污泥、雜藻和其它附屬雜質，用0.005-0.008％的HgCl₂溶液消毒5-10s，接著使用消毒海水沖洗干凈，切取新鮮藻體頂端幼嫩部分，用濾紙吸干表面水分，將其剪切或研磨成細小的組織塊或小的分枝，先在酒石酸鉀鈉和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)混合溶液中浸泡2-3h后，再利用海藻工具酶溶液進行消化酶解，然后經離心沉淀，獲得海藻體細胞原生質；

步驟二、將原生質體培養得到再生細胞壁的細胞，進一步培養即可得到再生植株。

作為優選，酒石酸鉀鈉和PVP分別配制成濃度為0.1-0.5M和3-6M的溶液，然后按體積比1:3-5混合而成；酒石酸鉀鈉和PVP相互協同，能夠使細胞壁表面纖維素發生膨脹，從而加速細胞壁溶解或破裂造成細胞質壁分離，同時能夠提高細胞膜的強韌度，最終能夠提高藻體酶解效率和確保獲得的原生質體的完整性。

作為優選，原生質體分離的操作為：用250-400目篩絹過濾細胞混合液，除去未消化的細胞、細胞團、碎片；取上清液500-850rpm離心8-10min，使單細胞(原生質體)下沉，細胞碎片留在上清液中，棄去上清液，用含有1.0-1.2M葡萄糖的消毒海水進行沖洗和離心2-3次，收集沉淀即得海藻原生質體。