[發明專利]海藻原生質體分離培養和再生植株的方法

有效

• 申請號: 201811494026.0
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109511550B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 王斌;張建設;楊靜靜
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京國翰知識產權代理事務所(普通合伙) 11696
• 代理人: 衛翠婷

1.海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，其特征在于：利用海藻工具酶分解海藻組織，得到體細胞原生質體，經由培養得再生植株；

所述海藻工具酶對海藻組織進行酶解前，先用酒石酸鉀鈉和聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液浸泡藻體；

所述酒石酸鉀鈉和聚乙烯吡咯烷酮的濃度分別為0.1-0.5M和3-6M，并按體積比1:3-5混合而成；

所述海藻為紅藻門。

2.根據權利要求1所述的海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一、選擇顏色正常、無腐爛、生長旺盛的藻體，用毛刷清理藻體表面污泥、雜藻和其它附屬雜質，用0.005-0.008%的HgCl₂溶液消毒5-10s，接著使用消毒海水沖洗干凈，切取新鮮藻體頂端幼嫩部分，用濾紙吸干表面水分，將其剪切或研磨成細小的組織塊或小的分枝，先在酒石酸鉀鈉和聚乙烯吡咯烷酮混合溶液中浸泡2-3h后，再利用海藻工具酶溶液進行消化酶解，然后經離心沉淀，獲得海藻體細胞原生質；

步驟二、將原生質體培養得到再生細胞壁的細胞，進一步培養即可得到再生植株。

3.根據權利要求1所述的海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，其特征在于：所述原生質體分離的操作為：用250-400目篩絹過濾細胞混合液，除去未消化的細胞、細胞團、碎片；取上清液500-850rpm離心8-10min，使原生質體下沉，細胞碎片留在上清液中，棄去上清液，用含有1.0-1.2M葡萄糖的消毒海水進行沖洗和離心2-3次，收集沉淀即得海藻原生質體。

4.根據權利要求1所述的海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，其特征在于：所述海藻工具酶為海螺酶或纖維素酶或兩者的組合；其中，海螺酶的制備方法為：將海螺洗凈暫養于消毒海水中饑餓2-3天，去殼取其消化腺，研磨至勻漿，10000-15000rpm離心5-10min，棄去沉淀，上清液中加入-10～-20℃預冷的丙酮，離心棄去沉淀，再重復加入丙酮離心收集沉淀得原酶液，于-5～-20℃保存備用；原酶液使用時用海水稀釋至15-25%；纖維素酶的配制方法為：用40-60mmol/L的檸檬酸或醋酸緩沖液溶解，濃度為10-15%，其中醋酸緩沖液用消毒海水配制。

5.根據權利要求1所述的海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，其特征在于：所述海藻工具酶使用時，加入滲透壓穩定劑，滲透壓穩定劑選自甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、KCl、NaCl中的一種；其中，醇類和糖類的適宜濃度為1.2-2.6M，KCl、NaCl的適宜濃度為0.5-0.8M。

6.根據權利要求1所述的海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，其特征在于：所述酶解條件為：pH為6，30℃下酶解3.5h。

7.根據權利要求1所述的海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，其特征在于：所述原生質體培養方式為：先將海藻酸鈉和原生質體等量混合滴于氯化鈣溶液中形成固定，再接種到液體培養基中培養；先保持溫度22-26℃下暗培養5-7天，然后轉為光照培養，光照時間為8-10h/d，光強為2500-3000Lx，每7天更換一半培養基；其中，液體培養基為含萘乙酸和2,4-氯苯氧乙酸的PES培養基，并以甘露醇和葡萄糖保持培養基滲透壓。

8.根據權利要求1所述的海藻原生質體分離培養和再生植株的方法，其特征在于：所述原生質體培養過程，當細胞進行第一次分裂后，在培養基中添加色氨酸和抗壞血酸鈉，并調節培養基pH為5.5-5.8，繼續培養；色氨酸和抗壞血酸鈉的添加量為培養基重量的1-5%和0.5-2%。