[發明專利]一種啟動子組合控制的動態調控系統

有效

• 申請號: 201811493330.3
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109576199B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 劉立明;高聰;侯建屾;葉超;陳修來;羅秋玲;劉佳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種啟動子組合控制的動態調控系統，具體公開了一種啟動子組合控制的涉及動態調控系統及其在莽草酸生產中的應用，屬于生物工程技術領域。本發明通過分子生物學手段，篩選出兩類轉錄特征完全不同的啟動子，即生長期關聯啟動子和穩定期啟動子。利用蛋白酶特異性識別切割特定短肽的性質，設計構建出不需要借助人為控制和外源添加誘導劑的蛋白豐度調控系統。通過在工程大腸桿菌中引入靶向莽草酸激酶的動態調控基因線路，實現了在無機鹽培養基中，不外源添加芳香族氨基酸和誘導劑生產莽草酸的能力。通過本發明生產的莽草酸產量可達21.2g/L，轉化率達0.24g/g葡萄糖。

技術領域

本發明涉及一種啟動子組合控制的動態調控系統，具體涉及一種啟動子組合控制的涉及動態調控系統及其在莽草酸生產中的應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

動態調控系統是代謝工程領域中新興的代謝流調控手段，其區別于靜態調控的主要特征是在發酵過程中，工程菌株會根據發酵時間，生理狀態，胞內代謝物濃度，胞外環境變化做出相應的酶活調整，進而影響代謝流分布，提高產品生產能力。動態調控系統具有發酵過程無需人為調控，不需要外源添加誘導劑的優勢，在生產高附加值化合物中具有顯著優勢。

目前的動態調控系統，主要是依靠群體感應系統進行控制的，即系統的觸發器是由本源或者異源的群體感應系統組成。當菌體濃度達到一定濃度時，群體感應系統釋放積累的小分子物質會作用于調控系統受體，使調控系統做出相應動作。如2017年，ApoorvGupta等人表于Nature biotechnology的動態系統，該系統由EsaI群體感應系統和靶蛋白C末端添加降解標簽組合而成，當菌體濃度達到一定閾值時，靶蛋白的被降解，胞內絕對濃度達到0，從而實現酶活關閉，調控代謝流的目的和效果。該系統具有路徑獨立特征，并成功應用于肌醇，葡萄糖二酸和莽草酸的生產應用。除此之外，2017年，Xinyuan He等人發表于ACSsynthetic biology的AND邏輯門動態調控系統由群體感應系統和穩定期感應蛋白組成。當菌體濃度達到一定閾值時，啟動靶蛋白的轉錄表達，從而實現代謝流調控目的和效果。該系統運用于PHB生產時，提高了1-2倍PHB產量。綜上所述，兩種動態調控系統均需要引入異源群體感應系統，然而，異源群體感應系統往往由多個轉錄調控蛋白組成，它的引入無疑會影響菌株的生長和發酵性能，同時限制了路徑酶的表達數量。

為了構建出更為精簡的動態調控系統，本發明提出了采用兩類能夠響應菌株生理狀態的啟動子組合，并結合蛋白質降解的思路。這兩類啟動子具有完全不同的轉錄特征，當菌株處于對數生長期時，生長期關聯啟動子(簡寫GPP)的轉錄活性極強，可以控制目標蛋白的大量轉錄及合成，而穩定期關聯啟動子(簡寫SPP)的轉錄活性受強烈抑制，不進行蛋白質的轉錄及合成。當菌株處于穩定期時，生長期關聯啟動子的轉錄活性受到抑制，目標蛋白的合成幾乎停滯，相反，穩定期關聯啟動子的轉錄活性大幅提高，促進了其控制蛋白的轉錄及合成。在此基礎上，組合生長關聯啟動子負責轉錄控制的具有N端隱藏降解子的靶蛋白和由穩定期關聯啟動子負責轉錄控制的蛋白酶，構建出動態調控基因線路。當菌株處于對數生長期時，靶蛋白能夠啟動合成，并在胞內積累，行使相應的生理代謝功能。當菌株進入穩定期后，蛋白酶受穩定期關聯啟動子控制表達，促進靶蛋白隱藏的N端降解子裸露，進而降解靶蛋白，關閉其相應的生理代謝功能。然而，不同的啟動子組合時，其轉錄起始時間存在差異，不同的組合方式調節基因表達的效果不同。

莽草酸是制備抗流感藥物達菲的前體藥，在大腸桿菌中由分支酸路徑合成。傳統的生產莽草酸方法是敲除菌株的莽草酸激酶I和II，以阻斷莽草酸到莽草酸-3-磷酸的合成通量，實現莽草酸的積累。然而，莽草酸-3-磷酸的下游產物包含大腸桿菌生長必需的芳香族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。直接阻斷莽草酸-3-磷酸的合成，將使菌株在無機鹽培養基中出現生長缺陷。為了促進菌株生長，現有技術需要在培養基中添加價格昂貴的芳香族氨基酸，或是增加產物分離難度的有機氮源，如胰蛋白胨，酵母粉等。因此，提供一種在簡單培養基中高產莽草酸的方法，對于工業制備莽草酸具有重要的意義。

發明內容