[發明專利]一種啟動子組合控制的動態調控系統

有效

• 申請號: 201811493330.3
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109576199B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 劉立明;高聰;侯建屾;葉超;陳修來;羅秋玲;劉佳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種基因工程菌，其特征在于，引入了含有生長期關聯啟動子的表達載體和含有穩定期關聯啟動子的表達載體；所述生長期關聯啟動子連有添加了N末端的蛋白酶識別切割位點的靶蛋白；所述穩定期關聯啟動子連有蛋白酶；所述N末端的蛋白酶識別切割位點被所述蛋白酶識別；所述基因工程菌以大腸桿菌為宿主；所述生長期關聯啟動子包括rrnB P1、rpsT P2或rpsJ；

所述穩定期關聯啟動子包括fic、bolA、S4或S60；

所述rrnB P1、rpsT P2、rpsJ、fic、bolA、S4、S60的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.2-SEQID NO.8所示。

2.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述靶蛋白為莽草酸激酶。

3.如權利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，穩定期關聯啟動子連有的蛋白酶為TEV蛋白酶。

4.如權利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，以PJ01-GABE-GPP-K和P_SPP-TEV為表達載體；

所述的PJ01-GABE-GPP-K質粒的構建方法為：

（1）以商業化質粒pTargetF為基礎，采用全質粒PCR的方式，在rrnB T1 終止子后插入T7Te終止子序列，以減少泄露表達；進一步地，采用全質粒PCR的方式，去除sgRNA表達框，獲得僅含有Pj23119組成型啟動子和雙終止的工程質粒pJ01；

（2）以大腸桿菌MG1655基因組為模板，分別擴增獲得含有B0034RBS的aro^Bopt、aroE、aroG^fbr、tktA片段，將aro^Bopt、aroE兩個片段采用多片段一步同源重組的方式，插入至pJ01的表達框中，獲得pJ01-BE質粒，以相同的方法，將aroG^fbr、tktA兩個片段采用多片段一步同源重組的方式，插入至pJ01的表達框中，獲得pJ01-GA質粒；

（3）以大腸桿菌MG1655基因組為模板，擴增獲得含有B0034RBS、N末端修飾的aroK片段，將該片段插入至pJ01質粒中，獲得pJ01-K質粒，利用酶切位點BglII和SpeI雙酶切質粒pJ01-K，并以相同的酶切位點插入合成生長關聯啟動子序列，獲得GPP-K質粒；

（4）采用同尾酶連接的方式利用BamHI、BglII和XbaI，分別將pJ01-GA、pJ01-BE、GPP-K質粒組裝，最終獲得質粒PJ01-GABE-GPP-K；

所述的P_SPP-TEV質粒的構建方法為：

合成穩定期關聯啟動子基因后，采用融合PCR的方式分別加上B0034RBS及GFP報告基因，將上述融合后的片段與載體pTet-1質粒連接，構建獲得重組質粒P_SPP-GFP；使用蛋白酶TEV基因片段置換上述P_SPP-GFP中的報告基因GFP，獲得質粒P_SPP-TEV質粒；所述載體pTet-1來源于商業化質粒pdCas9-bacteria，采用全質粒PCR的方式將pdCas9-bacteria中編碼dcas9蛋白的序列刪除，獲得的質粒重新命名為pTet-1。

5.一種調控靶蛋白基因表達的方法，其特征在于，用生長期關聯啟動子關聯連有添加了N末端的蛋白酶識別切割位點的靶蛋白表達，并用穩定期關聯啟動子關聯蛋白酶的表達；所述N末端的蛋白酶識別切割位點被所述蛋白酶識別；

所述生長期關聯啟動子包括rrnB P1、rpsT P2或rpsJ；

所述穩定期關聯啟動子包括fic、bolA、S4或S60；

所述rrnB P1、rpsT P2、rpsJ、fic、bolA、S4、S60的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.2-SEQID NO.8所示。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶為TEV蛋白酶。