[發(fā)明專利]一種快速構(gòu)建秀麗線蟲基因編輯所需目的pU6-sgRNA質(zhì)粒的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811491730.0
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109468338A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙培;康雅虹;謝喜珍
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州上源生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/66
• 代理公司: 福州市景弘專利代理事務(wù)所(普通合伙) 35219
• 代理人: 林祥翔;黃以琳

本發(fā)明屬于線蟲基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是一種快速構(gòu)建秀麗線蟲基因編輯所需目的pU6?sgRNA質(zhì)粒的方法，通過改造秀麗線蟲pU6?unc?119sgRNA原始載體，構(gòu)建pU6?2X BseRI?sgRNA質(zhì)粒，用BseRI酶切pU6?2X BseRI?sgRNA質(zhì)粒得到帶有粘性末端的載體，將包含了sgRNA靶序列及粘性末端的正反引物通過退火形成帶有粘性末端的sgRNA靶DNA小片段，在T₄DNA連接酶的作用下，載體與帶有相匹配的粘性末端的sgRNA靶DNA小片段連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，從轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌中篩選陽性單克隆，并測序驗(yàn)證sgRNA靶序列是否正確。使用該技術(shù)方案，構(gòu)建周期不到1天，T₄DNA酶連之前的工作耗時(shí)不到半個(gè)小時(shí)，比常規(guī)方法的純?nèi)斯ず臅r(shí)減少至少4個(gè)小時(shí)，構(gòu)建周期減少2天。構(gòu)建一個(gè)sgRNA質(zhì)粒只需合成包含44個(gè)堿基的兩條引物，大大減少了構(gòu)建成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于線蟲基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是一種快速構(gòu)建秀麗線蟲基因編輯所需目的pU6-sgRNA質(zhì)粒的方法。

背景技術(shù)

在考慮到經(jīng)濟(jì)成本和工作量的情況下，如今大多數(shù)線蟲實(shí)驗(yàn)室很少通過注射Cas9蛋白和轉(zhuǎn)錄好的sgRNA(single guide RNA簡稱)進(jìn)行基因編輯，而是多通過直接注射編碼Cas9和sgRNA質(zhì)粒的方法來改造基因組。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)最為關(guān)鍵的是尋找到合適的sgRNA靶位點(diǎn)，一方面需要sgRNA靶位點(diǎn)沒有脫靶效應(yīng)，另一方面需要sgRNA靶位點(diǎn)被sgRNA-Cas9二元復(fù)合物識(shí)別后能與Cas9穩(wěn)定結(jié)合，并被Cas9蛋白酶切形成雙鏈DNA切口。sgRNA在這兩個(gè)關(guān)鍵步驟發(fā)揮了重要的作用。

早先發(fā)現(xiàn)的引導(dǎo)RNA，由兩部分組成即tracRNA和crRNA，兩部分融合表達(dá)后，即sgRNA也能很好的行使引導(dǎo)的功能，與Cas9蛋白結(jié)合，引導(dǎo)Cas9酶靶向基因組DNA進(jìn)行剪切。目前工程化的sgRNA/Cas9系統(tǒng)中的sgRNA由兩部分組成，即sgRNA靶位點(diǎn)識(shí)別序列和sgRNA骨架序列。sgRNA靶位點(diǎn)序列是原始間隔序列相鄰基序PAM(5’-NGG-3’)上游的20bp序列，由G/A(N)₁₉組成，其中G/A(N)₁₉代表識(shí)別的sgRNA靶位點(diǎn)序列。如圖1所示pU6-unc-119sgRNA質(zhì)粒為例，線蟲中常用的sgRNA質(zhì)粒包含將近500bp的U6snRNA啟動(dòng)子，其后緊接sgRNA靶位點(diǎn)識(shí)別序列和sgRNA骨架序列以及將近300bp的U6snRNA下游序列。

對于不同位點(diǎn)的基因編輯，sgRNA骨架序列是相同的，而sgRNA靶位點(diǎn)識(shí)別序列不同。目前較多使用兩步PCR方法構(gòu)建線蟲sgRNA質(zhì)粒，F(xiàn)riedland AE1，TzurYB，Esvelt KM，Colaiácovo MP，Church GM，Calarco JA等人在“Heritable genome editing inC.elegans via a CRISPR-Cas9system”中公開了通過兩步PCR方法(見圖2)將如圖1所示EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)之間的序列(包括U6啟動(dòng)子、新的sgRNA靶位點(diǎn)識(shí)別序列、sgRNA骨架序列和U6snRNA下游序列)進(jìn)行替換，構(gòu)建帶有新的sgRNA靶位點(diǎn)序列的質(zhì)粒。FarboudB、Meyer B J在“Dramatic Enhancement of Genome Editing by CRISPR/Cas9ThroughImproved Guide RNA Design”中公開了通過Gibson組裝的方法將EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)之間的序列進(jìn)行替換。Arribere JA、Bell R T、Fu B X H等人在“Efficient Marker-Free Recovery ofCustom Genetic Modifications with CRISPR/Cas9inCaenorhabditis elegans”中公開了通過將包含sgRNA靶位點(diǎn)序列的互補(bǔ)引物與BsaI酶切后的pRB1017載體連接，構(gòu)建包含新sgRNA靶位點(diǎn)序列的sgRNA質(zhì)粒。