[發明專利]一種快速構建秀麗線蟲基因編輯所需目的pU6-sgRNA質粒的方法

在審

• 申請號: 201811491730.0
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109468338A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 趙培;康雅虹;謝喜珍
• 申請（專利權）人: 蘇州上源生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/66
• 代理公司: 福州市景弘專利代理事務所(普通合伙) 35219
• 代理人: 林祥翔;黃以琳

1.一種快速構建秀麗線蟲基因編輯所需目的pU6-sgRNA質粒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

構建pU6-2XBseRI-sgRNA質粒：以pU6-unc-119 sgRNA為原始載體，在U6啟動子和sgRNA骨架序列之間插入兩個相向的BseRI酶切位點，得到pU6-2XBseRI-sgRNA質粒；

BseRI酶切改造后的載體：BseRI酶切所述pU6-2XBseRI-sgRNA質粒，得到帶有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的載體，膠回收備用；

合成引物：合成包含sgRNA靶位點序列的正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物的末端帶有與所述帶有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的載體的黏性末端相匹配的堿基；

退火：將所述正向引物和反向引物退火，得到帶有黏性末端的sgRNA靶DNA小片段；

酶連：在T₄DNA連接酶的作用下，將所述帶有黏性末端的sgRNA靶DNA小片段與帶有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的載體進行連接，得到酶連產物；

轉化：將所述酶連產物轉化到DH5α感受態細胞；

挑單克隆、PCR篩選陽性菌、陽性菌測序、比對序列，提取所述帶有sgRNA靶位點序列的pU6-sgRNA質粒。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述pU6-2X BseRI-sgRNA質粒的堿基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述BseRI酶切改造后的載體步驟中用的酶切體系為：

所述pU6-2XBseRI-sgRNA質粒2ug，4μL；

10xCutsmart酶切緩沖液，10μL；

BseRI酶，2μL；

重蒸餾水，84μL。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述BseRI酶切改造后的載體步驟為：將所述酶切體系置于PCR管中混合，于37℃酶切消化1h后，不進行堿性磷酸酶處理，直接于80℃熱激處理終止酶切反應，得到酶切產物，將所述酶切產物跑1％凝膠電泳，回收3461bp片段進行純化，得到所述帶有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的載體。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述正向引物和反向引物分別為sg-F：5'-N₂₀GT-3'，其中N₂₀表示PAM序列5’-NGG-3’上游20bp sgRNA靶位點序列；sg-R：5'-n₂₀AA-3'，其中n₂₀表示N₂₀反向互補后的序列。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述退火步驟中用的退火體系為：

濃度為100μM的所述正向引物sg-F，1μL；

濃度為100μM的所述反向引物sg-R，1μL；

重蒸餾水，8μL。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述退火步驟中用的退火程序為：

95℃10min；85℃1min；75℃1min；65℃1min；55℃1min；45℃1min；35℃1min；25℃1min；15℃保存。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶連步驟中用的酶連體系為：

所述帶有黏性末端的sgRNA靶DNA小片段用重蒸餾水稀釋200倍的溶液，1.0μL；

所述帶有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的載體，0.5μL；

T₄DNA連接酶，1.0μL；

10xT₄DNA連接酶緩沖液，1.5μL；

重蒸餾水，11μL。