[發明專利]一種基于BTNAA體系檢測犬瘟熱病毒的引物對、引物和探針組合物、試劑及試劑盒

在審

• 申請號: 201811487274.2
• 申請日: 2018-12-06
• 公開（公告）號: CN109371171A
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 劉萌;陳科;吳瓊;陳姣姣;劉國憲
• 申請（專利權）人: 寧波匠神生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 余姚德盛專利代理事務所(普通合伙) 33239
• 代理人: 吳曉微

1.一種基于BTNAA體系檢測犬瘟熱病毒的引物對，其特征在于，所述引物對包括上游引物和下游引物；所述上游引物和所述下游引物的序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，具體如下：

上游引物：CTGCTMGCTAAAGCRGTGACTGCTCCTGATAC；

下游引物：CAATTCTAGGCTTGTTCCCTGGGGATCGTTTG。

2.一種基于BTNAA體系檢測犬瘟熱病毒的引物和探針組合物，其特征在于，所述引物和探針組合物包括引物和探針；所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物、所述下游引物和所述探針的序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，具體如下：

上游引物：CTGCTMGCTAAAGCRGTGACTGCTCCTGATAC；

下游引物：CAATTCTAGGCTTGTTCCCTGGGGATCGTTTG；

探針：

GAATTTAGAATGAACAAAATCTGGCTTGATAT(R)G(H)(B)AGAAACAGGATTGC-SpacerC3；

其中，R為熒光基團，H為四氫呋喃位點，B為猝滅基團，3’末端為SpacerC3修飾。

3.一種基于BTNAA體系檢測犬瘟熱病毒的試劑，其特征在于，所述試劑包括如權利要求1所述的一種基于BTNAA體系檢測犬瘟熱病毒的引物對或者包括如權利要求2所述的一種基于BTNAA體系檢測犬瘟熱病毒的引物和探針組合物。

4.如權利要求3所述的一種基于BTNAA體系檢測犬瘟熱病毒的試劑，其特征在于，所述試劑包括反應液，所述反應液包括聚乙二醇、Tris、乙酸鉀、三磷酸腺苷、磷酸肌酸二鈉鹽、脫氧核糖核苷三磷酸、蔗糖、甘油、重組酶、單鏈DNA結合蛋白、DNA聚合酶、輔助蛋白、反轉錄酶和核酸外切酶。

5.如權利要求4所述的一種基于BTNAA體系檢測犬瘟熱病毒的試劑，其特征在于，所述反應液經凍干后保存，待檢測時再溶于雙蒸水與所述引物和所述探針混合；所述凍干條件為：在-80℃條件下預凍3～4小時，預凍結束后放入真空冷凍干燥機中進行干燥，先于-20～-45℃干燥2～10小時，最后10～18℃干燥1～2小時。

6.如權利要求4所述的一種基于BTNAA體系檢測犬瘟熱病毒的試劑，其特征在于，所述重組酶選自T4噬菌體重組酶uvsX或大腸桿菌(E.coli)重組酶RecA；所述單鏈DNA結合蛋白選自T4或E.coli的gp32；所述DNA聚合酶選自Phi-29聚合酶、枯草芽胞桿菌PolI(Bsu)、Bst聚合酶、E.coli的DNA聚合酶IKlenow大片段中的任意一種；所述輔助蛋白為T4噬菌體uvsY蛋白；所述反轉錄酶選自莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶(M-MLV)或禽類成髓細胞瘤病毒反轉錄酶(AMV)；所述核酸外切酶選自E.coli的核酸外切酶exoIII或exoIV。

7.如權利要求6所述的一種基于BTNAA體系檢測犬瘟熱病毒的試劑，其特征在于，所述重組酶為大腸桿菌(E.coli)重組酶RecA；所述單鏈DNA結合蛋白為E.coli的gp32；所述DNA聚合酶為E.coli的DNA聚合酶IKlenow大片段；所述反轉錄酶為莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶(M-MLV)；所述核酸外切酶為E.coli的核酸外切酶exoIII。

8.如權利要求4所述的一種基于BTNAA體系檢測犬瘟熱病毒的試劑，其特征在于，所述反應液中各組分的濃度為：所述重組酶220～280ng/μl；所述單鏈DNA結合蛋白200～250ng/μl；所述DNA聚合酶100～150ng/μl；所述輔助蛋白70～100ng/μl；所述反轉錄酶150～200ng/μl；所述核酸外切酶80～120ng/μl；所述聚乙二醇2～4％；所述Tris 20～40mM；所述乙酸鉀100～140mM；所述三磷酸腺苷2～4mM；所述磷酸肌酸二鈉鹽40～60mM；所述脫氧核糖核苷三磷酸250～300μM；所述蔗糖5～8％；所述甘油20～40％。