[發明專利]基于N-烷基化法的多種氨基代謝物同步定量分析方法

在審

• 申請號: 201811485237.8
• 申請日: 2018-12-06
• 公開（公告）號: CN109580814A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 唐惠儒;彭葉青;薛海斯
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

本發明屬于代謝組學及生命分析化學技術領域，具體為基于N?烷基化法的多種氨基代謝物同步定量分析方法。本發明步驟包括：氨基代謝物標準溶液的配制；氨基代謝物的烷基化反應；采用UHPLC?MS/MS對多種烷基化氨基代謝物的定量檢測分析。本發明采用還原胺化法，利用NaBH₃CN/NaBD₃CN和五種醛（乙醛，丙醛，丁醛，戊醛和己醛）對代謝物的氨基烷基化（乙基化，丙基化，丁基化，戊基化，己基化）修飾，不僅改善了氨基代謝物在色譜反相柱上保留，提高其質譜離子化效率，還可實現更為精準的同位素內標定量測量。本發明衍生化條件溫和、反應效率高、易于淬滅且后處理簡單，具有較高檢測靈敏度。

技術領域

本發明屬于人體氨基代謝物測量技術領域，具體涉及基于N-烷基化衍生方法的多種氨基代謝物同步定量分析方法。

背景技術

含有氨基的代謝物(氨基代謝物)是一類重要的生物代謝物，涵蓋數十個重要的代謝通路。它們在維持氧化還原平衡、蛋白質與核酸及神經遞質的合成、能量代謝等多個方面具有重要功能。因此其含量變化與糖尿病、肝病等多種疾病的發生發展機制密切相關。譬如，支鏈氨基酸在糖尿病及患有嚴重肝臟疾病的病人與正常人體液中含量具有明顯差異；多巴胺含量下降與帕金森病直接相關；5-羥色胺對記憶、抑郁和焦慮型障礙有關鍵作用等。因而，氨基代謝物的高通量同步定量分析對疾病的精準診療具有重要意義。

由于生物基質的復雜性以及氨基代謝物較多的種類和較大的濃度動態范圍，目前基于UHPLC-MS的氨基代謝物定量分析存在以下難點：第一，這類代謝物大多極性強，不適用于反相柱分離，而親水色譜的重現性較差并需要較長的柱平衡時間；第二，部分代謝物的離子化效率低，靈敏度不高；第三，由于生物基質的復雜，通過外標法很難實現準確定量，而同位素內標價格昂貴且不易獲得。

為了解決以上問題，需通過衍生化增加氨基代謝物的疏水性，且衍生化試劑需反應條件溫和，特異性強，效率高，易淬滅，后處理簡單，可引入穩定同位素，從而通過色譜質譜技術實現準確內標定量。

發明內容

本發明的目的是提供一種反應條件溫和，特異性強，效率高，易淬滅，后處理簡單的多種氨基代謝物同步定量分析方法。

本發明提供的多種氨基代謝物同步定量分析方法，是基于氨基代謝物的一類N-烷基化柱前衍生化方法(簡稱“N-烷基化法”)，然后通過UHPLC-MS/MS方法同時對多種人體氨基代謝物進行高靈敏的內標定量分析。本發明方法易操作且檢測靈敏度高。

本發明提供的基于N-烷基化法的多種氨基代謝物同步定量分析方法，具體步驟如下：

(1)氨基代謝物標準溶液的配制：取氨基代謝物標品，用體積比50-70％的甲醇水溶液配制成濃度為10-600μM的標準溶液；

(2)氨基代謝物的衍生化反應：在含N-乙基馬來酰亞胺(NEM，其濃度為2-5倍氨基代謝物濃度)的磷酸緩沖液中(緩沖液濃度為0.1-0.3M，pH為7-8)，加入氨基代謝物標準溶液，20-30℃反應1-20min，然后加入4-叔丁基苯硫酚(tBBT，其濃度為5-10倍NEM濃度)，20-30℃反應2-10min，再加入含三(2-羧乙基)膦(TCEP，其濃度為5-20倍氨基代謝物濃度)和抗壞血酸(Vc，其濃度為5-20倍氨基代謝物濃度)的醋酸緩沖液(保證反應液中濃度為0.1-0.5M，pH為5-7)，渦旋混勻10-20min，再加入NaBH₃CN或者NaBD₃CN(其濃度為100-200倍氨基代謝物濃度)，渦旋混勻，再加入醛溶液(這里醛為乙醛、丙醛、丁醛、戊醛或者己醛，其濃度為250-500倍氨基代謝物濃度)，25-37℃反應12-24h；然后用鹽酸調節反應液pH至2-3，淬滅反應，稀釋后加入內標(圖1為衍生化反應流程)；

(3)烷基化氨基代謝物的檢測：采用UHPLC-MS/MS(超高效液相色譜-串聯質譜)進行測定。