[發(fā)明專利]基于N-烷基化法的多種氨基代謝物同步定量分析方法

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• 申請日: 2018-12-06
• 公開（公告）號: CN109580814A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐惠儒;彭葉青;薛海斯
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1.基于N-烷基化法的多種氨基代謝物同步定量分析方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）氨基代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取氨基代謝物，用體積比50-70%的甲醇水溶液配制成濃度為10-600μM的標(biāo)準(zhǔn)溶液；

（2）氨基代謝物的衍生化反應(yīng)：在含N-乙基馬來酰亞胺（NEM）的磷酸緩沖液中，加入氨基代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，20-30℃反應(yīng)1-20min；然后加入4-叔丁基苯硫酚（tBBT），20-30℃反應(yīng)至少2 min，再加入含三(2-羧乙基)膦（TCEP）和抗壞血酸（Vc）的醋酸緩沖液，渦旋混勻至少10min；再加入NaBH₃CN或者NaBD₃CN，渦旋混勻；再加入醛溶液，25-37℃反應(yīng)12-24h；然后用鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至2-3，淬滅反應(yīng)，稀釋后加入內(nèi)標(biāo)；

（3）烷基化氨基代謝物的檢測：采用UHPLC-MS/MS進(jìn)行測定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，所述氨基代謝物包括：亮氨酸、甘氨酸、半胱氨酸這些必需氨基酸，以及S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷高半胱氨酸這些含腺苷類氨基代謝物，組氨酸，多巴胺這些神經(jīng)遞質(zhì)，以及其他類別的氨基代謝物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，衍生化反應(yīng)采用不含穩(wěn)定同位素標(biāo)記的NaBH₃CN對代謝物進(jìn)行衍生化處理，得到不帶標(biāo)記的衍生物，稱為輕標(biāo)；而采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑NaBD₃CN對代謝物進(jìn)行衍生化處理，得到含氘標(biāo)記的衍生物，稱為重標(biāo)，重標(biāo)可作為內(nèi)標(biāo)用于定量分析。

4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，反應(yīng)體系中，NEM的濃度為2-5倍氨基代謝物濃度；磷酸緩沖液濃度為0.1-0.3 M，pH為7-8。

5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，tBBT的濃度為5-10倍NEM濃度， TCEP濃度為5-20倍氨基代謝物濃度，Vc濃度為5-20倍氨基代謝物濃度；反應(yīng)液中濃度為0.1-0.5M，pH為5-7。

6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或5所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，NaBH₃CN或者NaBD₃CN的濃度為100-200倍氨基代謝物濃度；所述的醛為乙醛、丙醛、丁醛、戊醛或己醛，其濃度為250-500倍氨基代謝物濃度。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（3）中，測定條件為：

a、色譜條件：使用UHPLC系統(tǒng)，采用C18反相色譜柱；流動相A配置為含有0.05-0.1%甲酸的雙蒸水，流動相B為含有0.05-0.1%甲酸的乙腈；流速設(shè)為0.400-0.600 mL/min，進(jìn)樣量設(shè)為0.2-5.0 μL，柱溫設(shè)為35-45℃；

b、質(zhì)譜條件：使用QqQ MS 系統(tǒng)，采用ESI離子源，干燥氣溫度：150-290℃，干燥氣流量：10-20 L/min，霧化器壓力：40-60 psi，鞘氣溫度：250-400℃，鞘氣流量：5-12L/min，毛細(xì)管電壓：3500-4000 V，噴嘴電壓：400-600 V；數(shù)據(jù)采集使用正離子、DMRM模式，采樣前0.5 min進(jìn)廢液瓶。