[發明專利]含單分子標簽的測序接頭和測序文庫的構建方法

有效

• 申請號: 201811483755.6
• 申請日: 2018-12-06
• 公開（公告）號: CN109576347B
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 張曉妮;許明炎;方文;屈宏越
• 申請（專利權）人: 深圳海普洛斯醫療器械有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C12N15/11;C40B50/06;C40B80/00
• 代理公司: 深圳舍穆專利代理事務所(特殊普通合伙) 44398
• 代理人: 黃賢炬

本發明提供了一種含單分子標簽的測序接頭和測序文庫的構建方法，該接頭通過第一核苷酸單鏈與第二核苷酸單鏈部分結合而形成，其中，第一核苷酸單鏈包括單分子標簽和第一測序引物序列，并且第二核苷酸單鏈包括樣本標簽、以及與第一測序引物序列部分互補的第二測序引物序列。在本發明中，在測序的生物信息學分析中，能夠通過DNA片段比對到參考基因組上的位置和單分子標簽識別重復的DNA片段，并且將重復的DNA片段進行對比以識別真正的基因變異，從而能夠提高測序的準確性。

技術領域

本發明屬于基因測序領域，特別涉及一種含單分子標簽的測序接頭和測序文庫的構建方法。

背景技術

高通量測序技術(High-throughput sequencing，HTS)可以一次性對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定，從而能夠對一個物種的基因組、轉錄組和表觀遺傳改變等進行細致全貌的分析，高通量測序技術又被稱為“深度測序”(Deep sequencing)。隨著高通量測序技術的興起以及測序成本的大幅降低，基因測序在精準醫療領域，如腫瘤基因檢測、遺傳病基因檢測、產前檢測等有著廣闊的應用前景。

以癌癥早期篩查為例，在癌癥患者的體液內，可以檢測到由腫瘤細胞凋亡和裂解釋放的循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA)，約占cfDNA的1％，甚至0.01％，可以通過對腫瘤患者ctDNA進行測序，檢測到癌癥相關基因突變信息。而在孕婦的cfDNA中，約有10％-15％的cfDNA來自于胎兒，可以通過對孕婦cfDNA進行測序，篩查胎兒的遺傳缺陷。然而，在上述測序中，例如cfDNA所包含的基因突變豐度較低，因此迫切需要測序精度更高，準確度更高的測序方法。

目前，針對這種二代測序技術(Next-Generation Sequencing)，具有通量高、成本低、準確性高等優點成為目前使用最為廣泛的高通量測序技術。二代測序技術的基本原理是邊合成邊測序。在文庫構建過程中，將DNA隨機片段化，并在片段化后的DNA兩端添加特定測序接頭(Adaptor)，然后進行文庫PCR擴增。構建好的DNA文庫在進行測序時通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列。二代測序技術的準確性可達到98％以上。但是其文庫在構建過程中引入了PCR擴增過程，而PCR擴增的偏好性和錯誤率，增加了二代測序的錯誤率。因此，需要開發一種精度更高準確度更高的建庫技術，以適應低豐度DNA的測序要求。

發明內容

本發明是鑒于上述現有技術的狀況而完成，其目的在于提供一種能夠提高二代測序準確的測序接頭及測序文庫的構建方法。

為此，本公開提供了一種含單分子標簽的測序接頭，該測序接頭通過第一核苷酸單鏈與第二核苷酸單鏈部分結合而形成，其中，第一核苷酸單鏈包括單分子標簽和第一測序引物序列，并且第二核苷酸單鏈包括樣本標簽、以及與所述第一測序引物序列部分互補的第二測序引物序列。

在本公開的一方面中，含單分子標簽的測序接頭由第一核苷酸單鏈與第二核苷酸單鏈部分結合而形成。其中，第一核苷酸單鏈包括單分子標簽和第一測序引物序列，并且第二核苷酸單鏈包括樣本標簽、以及與所述第一測序引物序列部分互補的第二測序引物序列。在這種情況下，能夠在測序的生物信息學分析中，通過DNA片段比對到參考基因組上的位置和單分子標簽識別重復的DNA片段，并且將重復的DNA片段進行對比以識別真正的基因變異，從而能夠提高測序的準確性。

另外，在本公開的一方面所涉及的測序接頭中，所述測序接頭可以為Y字型接頭。在這種情況下，單分子標簽和樣本標簽分別位于Y字型接頭的兩條單鏈上，因此能夠有效地抑制單鏈上的單分子標簽對樣本標簽的干擾。

另外，在本公開的一方面所涉及的測序接頭中，所述第一核苷酸單鏈還可以包括第一通用引物序列，并且所述第二核苷酸單鏈還可以包括第二通用引物序列。在這種情況下，能夠將測序接頭中未結合部分的兩端的序列作為正反向引物。