[發明專利]一種DNA聚合酶、重組載體及它們的制備方法和應用

有效

• 申請號: 201811482114.9
• 申請日: 2018-12-05
• 公開（公告）號: CN109679932B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 朱奇;劉偉華;廖傳榮
• 申請（專利權）人: 廣州奇輝生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/70;C12N15/10
• 代理公司: 廣州容大專利代理事務所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種適用于多重PCR靶向測序的高保真DNA聚合酶、含所述DNA聚合酶的重組載體及它們的制備方法和應用。本發明的DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；編碼所述DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。同時本發明提供一種包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的重組載體以及上述DNA聚合酶、重組載體的制備方法和應用方法。本發明的DNA聚合酶、重組載體具有超強的擴增效率和擴增保真性，能夠適用于多引物對數的多重PCR技術。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種DNA聚合酶、含所述DNA聚合酶編碼序列的重組載體及它們的制備方法和應用。

背景技術

聚合酶鏈式反應(PCR)，因為其方便、快捷、準確地大規模復制目的基因片段的能力，在生命科學研究與相關領域，如醫學檢測、感染性疾病檢測、法醫學檢測分子進化等，成為了無法取代的技術手段。

多重PCR(multiplex PCR)是在常規PCR基礎上進行升級改進的技術手段。對比常規PCR，多重PCR是在一個PCR反應體系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段，在相同的單位時間內獲得更多的擴增產物，大大提高了擴增效率，同時降低了時間與試劑成本。

作為多重PCR的核心工具，DNA聚合酶在擴增反應中的作用很關鍵。DNA聚合酶性能會直接影響擴增效率、靈敏度、保真性等。市面上高保真DNA聚合酶，相比于非高保真酶如Taq DNA聚合酶，具有3'-5'外切酶的即時校正活性，可以即時識別并切除錯配核苷酸，因而能夠最大程度的避免DNA復制中產生的錯誤，被廣泛應用于分子診斷、大規模平行測序等高靈敏度檢測應用中；然而正是由于其校正活性，通常的高保真DNA聚合酶擴增效率較低，堿基延伸速度與擴增片段的長度低于普通的Taq DNA聚合酶。

目前靶向測序主要有兩種方式來富集目標序列，一是多重PCR富集，二是液相雜交富集。多重PCR富集因為能夠適應更低的上樣要求與簡單方便的操作，而逐漸在靶向測序中占得上風，成為愈來愈多靶向測序的優選方法。市面上常見的高保真DNA聚合酶如pfu DNA聚合酶等，擴增效率較差，只能滿足于引物對數少于20對的多重PCR反應，無法滿足大規模平行測序NGS中檢測的多引物對要求，限制了多重PCR在靶向測序的使用和推廣。

發明內容

鑒于此，有必要針對上述問題提供一種適用于多重PCR靶向測序的高靈敏度、高擴增效率的高保真DNA聚合酶、含所述DNA聚合酶編碼序列的重組載體及它們的制備方法和應用。本發明的高保真DNA聚合酶，具有超強的擴增效率和擴增保真性，能夠適用于多引物對數的多重PCR。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種高保真DNA聚合酶，命名為Mup DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述Mup DNA聚合酶在核酸擴增中的應用，Mup DNA聚合酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

一種編碼所述Mup DNA聚合酶的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。SEQID NO:2所示序列中，Linker序列為“ggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagc”；His標簽序列為“catcatcatcatcatcat”。Linker之前的序列為優化后的Pfu DNA聚合酶DNA序列，Linker與His標簽之間的為優化后的Sso7d序列。

一種重組載體，其含有編碼Mup DNA聚合酶的DNA分子，該DNA分子具有如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。

優選地，上述的重組載體為含有T7啟動子、lac操縱子的重組載體。

一種高保真DNA聚合酶的制備方法，包括以下步驟：