[發明專利]一種DNA聚合酶、重組載體及它們的制備方法和應用

有效

• 申請號: 201811482114.9
• 申請日: 2018-12-05
• 公開（公告）號: CN109679932B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 朱奇;劉偉華;廖傳榮
• 申請（專利權）人: 廣州奇輝生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/70;C12N15/10
• 代理公司: 廣州容大專利代理事務所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年

1.一種DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，編碼所述DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一種重組載體，其特征在于，所述載體包含如權利要求1中所述的核苷酸序列。

3.根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體還含有T7啟動子、lac操縱子。

4.一種DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)設計得到如權利要求1中所述的編碼所述DNA聚合酶的核苷酸序列，并合成DNA分子；

(2)取步驟(1)得到的DNA分子與表達載體融合，構建重組表達載體；

(3)取步驟(2)得到的重組表達載體轉入宿主細胞，獲得轉化體；

(4)擴大培養步驟(3)中得到的轉化體，誘導表達，收集表達產物；

(5)純化步驟(4)中得到的表達產物，獲得該高保真DNA聚合酶。

5.根據權利要求4所述的DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的核苷酸序列設計方法包括：①獲得Pfu DNA聚合酶的cDNA序列和Sso7d序列；②對Pfu DNA聚合酶的cDNA序列進行堿基優化，再進行密碼子偏好性優化；③對Sso7d序列進行堿基優化；④將②、③優化得到的序列組成融合序列。

6.根據權利要求5所述的DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述步驟②中對Pfu DNA聚合酶的cDNA序列進行的堿基優化實現：原pfu蛋白序列的第54號氨基酸由異亮氨酸I變成亮氨酸L、第72號氨基酸由谷氨酸E變成谷氨酰胺Q、第157號氨基酸異亮氨酸I刪除、第176號氨基酸由異亮氨酸I變成谷氨酸E、第177號氨基酸由天冬氨酸D變成絲氨酸S。

7.根據權利要求5所述的DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述步驟②對Pfu DNA聚合酶的cDNA序列進行密碼子偏好性優化的原則包括：

A、同一氨基酸選擇大腸桿菌使用頻率較高的密碼子，若某種氨基酸有多個密碼子且使用頻率相同，多種密碼子盡量均勻分布；

B、避免Xho I、Bgl II、Sal I、Xba I酶切位點；

C、避免序列出現6個以上連續堿基。

8.根據權利要求5所述的DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述步驟③對Sso7d序列進行堿基優化實現：原Sso7d蛋白序列的第11號氨基酸由谷氨酸E變成谷氨酰胺Q、第38號氨基酸由甘氨酸G變成絲氨酸S。

9.根據權利要求4所述的DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)所用到的宿主細胞為大腸桿菌。

10.權利要求1所述DNA聚合酶、權利要求2或3所述的重組載體或權利要求4-9任意一項所述的制備方法所制得的DNA聚合酶在核酸擴增中的應用。