[發明專利]一種綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201811481106.2
• 申請日: 2018-12-05
• 公開（公告）號: CN109652451A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 王桂軍;劉光清;周曉雅;周祺;邢雪;許澤軍;顧香雪;黃榮
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12N15/54;C12R1/91
• 代理公司: 合肥興東知識產權代理有限公司 34148
• 代理人: 姜玲燕

1.一種綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系的構建方法，其特征在于：具體步驟如下：

1)重組質粒構建：根據人的端粒酶的全基因序列設計一對擴增hTERT基因PCR特異性引物，將擴增的hTERT基因重組轉載到重組質粒pLOV-CMV上，獲得重組質粒pLOV-CMV-hTERT；

2)慢病毒樣顆粒的制備：對步驟1)重組質粒pLOV-CMV-hTERT用試劑盒進行純化得無內毒素的重組質粒pLOV-CMV-hTERT，將無內毒素的重組質粒pLOV-CMV-hTERT、包裝質粒pSPAX2以及外膜質粒pMD2.G質粒用轉染試劑共轉染到293T細胞中，轉染30h收集細胞上清液，并置于-80℃保存；

3)表達hTERT基因的細胞系構建和篩選：用步驟2)中慢病毒樣顆粒的細胞培養上清液感染綿羊睪丸細胞，用嘌呤霉素培養基進行篩選；

4)hTERT基因表達及其mRNA轉錄水平檢測：提取步驟3)篩選后細胞系的總DNA和總RNA，用PCR檢測hTERT基因表達，用RT-PCR方法檢測hTERT基因的mRNA轉錄水平；

5)hETRT蛋白表達檢測：取步驟3)細胞系的細胞進行Western blotting檢測和間接免疫熒光檢測，以鑒定hTERT蛋白的表達。

2.根據權利要求1所述的一種綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系的構建方法，其特征在于：所述hTERT基因PCR特異性引物的序列如下：

hTERT-Nhe Ⅰ-F：5’-CTAGCTAGCTAGATGCCGCGCGCTCCCCGCT-3’，

hTERT-Not Ⅰ-R：5’-TTGCGGCCGCTCAGTCCAGGATGGTCTTGAA-3’。

3.根據權利要求1所述的一種綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟3)中嘌呤霉素培養基的嘌呤霉素濃度為0.75μg/mL。

4.根據權利要求1所述的一種綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟5)中Western blot檢測中，一抗為Flag標簽單抗，β-actin為內參蛋白，二抗為辣根酶標記的抗鼠二抗；間接免疫熒光檢測中，一抗為hTERT多克隆抗體，二抗為Alexa Fluor594 Goat Anti-rabbit IgG。

5.根據權利要求1所述的一種綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系的構建方法，其特征在于：所述hTERT基因的基因序列如SEQ ID No.1所示。

6.根據權利要求1所述的一種綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系的構建方法，其特征在于：所述hTERT基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

7.一種采用權利要求1-6任一項綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系構建方法構建的細胞系在病毒感染實驗中的應用。