[發明專利]一種綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201811481106.2
• 申請日: 2018-12-05
• 公開（公告）號: CN109652451A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 王桂軍;劉光清;周曉雅;周祺;邢雪;許澤軍;顧香雪;黃榮
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12N15/54;C12R1/91
• 代理公司: 合肥興東知識產權代理有限公司 34148
• 代理人: 姜玲燕

本發明公開了1.一種綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系的構建方法，大致步驟如下：1)重組質粒構建；2)慢病毒樣顆粒的制備；3)hTERT基因的細胞系構建和篩選；4)hTERT基因表達及其mRNA轉錄水平檢測；5)hETRT蛋白表達檢測。本發明構建方法有利于改善目前細胞系匱乏的研究現狀，有利于資源的推廣使用。綿羊羊睪丸永生化細胞系的建立減少了實驗動物的使用量，提供了一種更為穩定的實驗研究對象。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系的構建方法及其應用。

背景技術

細胞永生化(immortalization)是指細胞自發或受外界因素影響逃離增殖危機，從而獲得無限增殖的能力。自發性的細胞永生化概率很小，對于嚙齒類動物為10^-5～10^-6，人類細胞概率更低，小于10^-12。正常動物細胞在體外增殖培養是有限的，該自然極限稱為海弗里克極限(Hayflick limit)，細胞生長代謝的過程需要復雜的調節網絡，一旦該網絡發生錯誤，細胞會跨越自然極限，形成永生化。細胞的分裂增殖過程會要經過衰老期M1期和致死期M2期，跨越這兩期的細胞可實現永生化。真核細胞內存在多種抑癌基因如p53、pRb、DPC4、BRCA1等，抑癌基因表達下調與端粒酶的相互作用可能對細胞癌變及永生化產生影響。有學者從人乳腺癌細胞核中分離得到p53蛋白，進一步的試驗證明p53蛋白可以體外抑制端粒酶的活性。同時期，人們發現p53基因突變可以導致端粒酶激活，從而促使細胞的永生化。通過不同放射性元素如X射線、核輻射、電離輻射等刺激細胞也可實現細胞永生化，有研究中發現核彈輻射后的人皮細胞具有無限增殖的能力。通過基因轉染等技術，可將病毒的基因、原癌基因、端粒酶等導入目的細胞內，或者可以延長細胞傳代次數或者實現完全細胞永生化。

端粒是位于真核細胞染色體兩端末端，由長度為5～15bp的重復DNA序列和周圍蛋白質組成的帽狀結構。端粒可以保證染色體的完整性，同時調節細胞生命周期，端粒的功能障礙會直接導致細胞增殖停止和凋亡。端粒酶由RNA和蛋白質組成，是一種逆轉錄酶。端粒酶利用自身的RNA為模板，可以延伸端粒3’末端或者合成新的端粒DNA。因此端粒酶可以維持端粒結構和長度穩定，還可以提高細胞對應急預案和毒力因子的耐受力，在細胞永生化過程發揮重要作用。人端粒酶逆轉錄酶亞基(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)首次在人類宮頸癌細胞中發現，同時還發現了端粒酶RNA(telomerase RNA，TR)和端粒酶相關蛋白(telomerase-associated protein，TEP)。目前的研究表明，端粒(telomere)及端粒酶(telomerase)與細胞永生化有關。約80％的腫瘤細胞和永生化細胞系端粒酶活性檢測均為陽性，其余腫瘤細胞和永生化細胞系可檢測出足夠的端粒長度。因此，惡性腫瘤的治療方案中使用降低端粒酶的方法曾一度受到廣泛關注。但是，惡性腫瘤前期細胞端粒很短，而且端粒短的人更能抵抗黑色素瘤。這與前期的研究結果是相互矛盾的。Hockemeyer等發現，永生化分兩個過程，首先是端粒酶的突變引起的，端粒酶基因上游的啟動子(TERT)發生突變，但是該突變水平很低，還不足以使癌細胞永生化，但可以延緩細胞衰老，且端粒酶水平會逐漸上調；第二步，含有短端粒的染色體可能發生功能異常，促使基因組的改變，從而細胞實現永生化。這也解釋了，端粒較短，但端粒酶水平高的細胞更容易演變成癌細胞的原因。因此，運用質粒轉導及病毒感染等方法，將端粒酶基因導入細胞，端粒酶的表達及激活是實現細胞永生化的重要步驟。

由于目前還沒有建立綿羊睪丸永生化細胞系的先例，因此本研究以建立永生化羊睪丸細胞系為目的，通過向體外羊睪丸細胞導入外源性基因，成功建立了綿羊羊睪丸細胞永生化的方法。

發明內容

本發明的目的正是為了解決上述問題，而提出一種綿羊羊睪丸細胞永生化細胞系的構建方法，有利于改善目前細胞系匱乏的研究現狀，有利于資源的推廣使用。綿羊羊睪丸永生化細胞系的建立減少了實驗動物的使用量，提供了一種更為穩定的實驗研究對象。