[發明專利]一種半連續液體培養高效生產靈芝多糖的方法

有效

• 申請號: 201811477815.3
• 申請日: 2018-12-05
• 公開（公告）號: CN109251951B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 鄭濤
• 申請（專利權）人: 黑龍江卓健生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京中慧創科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11721
• 代理人: 王馨

1.一種半連續液體培養高效生產靈芝多糖的方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下：

（1）母種的活化擴繁

用接種鏟挖取保存在PDA斜面上的大小為0.5cm²的靈芝母種，接種到新鮮的PDA斜面試管中，于28℃恒溫培養5d，用直徑為1cm的打孔器將已活化的靈芝母種接種于PDA平板培養基中央，于28℃恒溫培養6~7d，待菌絲長滿平板后接種；

（2）搖瓶菌種的制備

用直徑1cm的打孔器，從平板上取2~3個大小相同的菌絲塊接入裝有液體培養基的錐形瓶中，裝液量為400mL/1L，于29~31℃、130~150r/min條件下恒溫振蕩培養3~4d；

（3）種子液的制備

將液體培養基按照60~70%的裝液量裝入種子罐中進行高壓蒸汽滅菌，滅菌結束后，等到培養基溫度冷卻至30℃左右時，將上述搖瓶菌種接入種子罐，接種量為6~10%，培養溫度為29~31℃，轉速為130~150r/min，培養5~6d即可獲得種子液；

（4）一氧化氮和乙烯協同誘導處理

將發酵培養基按照60~70%的裝液量裝入發酵罐①中進行高壓蒸汽滅菌，滅菌結束后，等到培養基冷卻后，將上述種子液接入發酵罐①，接種量為8~12%，培養溫度為29~31℃，轉速為110~130r/min，向發酵罐①中先后通入一氧化氮和乙烯高純氣體，進行協同誘導處理8h；

（5）半連續液體培養

a）待協同誘導處理結束后，向發酵罐①中通入凈化空氣，通氣量為0.5~0.7（V/V·min），培養溫度和轉速不變，培養40h后將轉速調整為130~150r/min，通氣量調整為1.0~1.2（V/V·min），在此條件下培養18h，然后放出部分體積的發酵液到經過空消滅菌處理的發酵罐②中，再補加相同體積的發酵培養基；

b）發酵罐②中同時也補加相同體積的發酵培養基，培養溫度為29~31℃，轉速為130~150r/min，通氣量為1.0~1.2（V/V·min），發酵液pH調整為4.4~4.6；

c）發酵罐①補加發酵培養基后，在與發酵罐②相同的培養條件下繼續培養48h，然后重復放出發酵液到發酵罐②，兩個發酵罐補加發酵培養基繼續培養48h的操作，如此重復進行3個周期；

d）3個周期結束后，將兩個發酵罐的轉速調整為110~130r/min，通氣量調整為0.5~0.7（V/V·min），培養溫度保持不變，培養36h后結束培養，放罐。

2.根據權利要求1所述的一種半連續液體培養高效生產靈芝多糖的方法，其特征在于，所述步驟（2）和步驟（3）中，液體培養基的成分為：葡萄糖20~25g/L，玉米粉11~15g/L，酵母浸粉1.8~2.2g/L，干酪素3.7~4.3g/L，油菜秸稈粉2.1~2.3g/L，羧甲基纖維素鈉3.0~4.0g/L，KH₂PO₄ 1.8~2.2g/L，MgSO₄ 0.9~1.1g/L，胡蘿卜汁26~34ml/L，蚯蚓干粉4.4~5.0g/L，ZnSO₄0.07~0.11g/L，四甲基戊二酸 5.4~5.8mg/L，松針提取液12~15ml/L，硬脂酸33~39mg/L，pH調節為5.2~5.4。

3.根據權利要求1所述的一種半連續液體培養高效生產靈芝多糖的方法，其特征在于，所述步驟（3）和步驟（4）中，高壓蒸汽滅菌的條件為溫度121-123℃，壓力0.11-0.13MPa，滅菌時間40-50min。

4.根據權利要求1所述的一種半連續液體培養高效生產靈芝多糖的方法，其特征在于，所述步驟（4）中，發酵培養基的成分為：玉米粉24~28g/L，麥麩15~19g/L，木質素8.5~9.3g/L，酵母破碎液15~20ml/L，椰糠粉3.8~4.4g/L，大豆粉5.5~6.5g/L，羧甲基纖維素鈉2.6~3.0g/L，三七藥渣5.9~6.5g/L，穿心蓮藥渣3.3~3.9g/L，茯苓藥渣5.2~5.8g/L，松針提取液12~15ml/L，KH₂PO₄ 1.8~2.2g/L，MgSO₄ 0.9~1.1g/L，硝酸鑭13~15mg/L，有機硅消泡劑30~40mg/L，初始pH調節為5.2~5.4。