[發(fā)明專利]基于器官芯片的二甲雙胍對糖尿病腎病保護(hù)作用評價方法

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• 申請日: 2018-12-05
• 公開（公告）號: CN111269829A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦建華;陶婷婷;李中玉;張敏
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12Q1/02
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 張晨

本發(fā)明公開了一種基于器官芯片的二甲雙胍對糖尿病腎病保護(hù)作用評價方法，特別是利用原代大鼠腎小球微組織來構(gòu)建糖尿病腎小球模型，本次研究所用微流控器官芯片主要結(jié)合微加工和組織工程技術(shù)，構(gòu)建出具有生理功能的濾過屏障。同時，在芯片上添加高糖10~30mM葡萄糖建立體外糖尿病腎小球模型，高糖10~30mM葡萄糖（Glucose,Glu）和50~150 mM二甲雙胍（Metformin,Met）建立體外二甲雙胍對糖尿病腎小球的治療組，研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以通過減少氧化應(yīng)激產(chǎn)物（ROS）生成，減少細(xì)胞外緊密連接蛋白破壞（ZO?1），抑制腎小球足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的上皮細(xì)胞的間質(zhì)化（EMT）行為降低高糖刺激對腎臟功能的損傷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及將微流控芯片技術(shù)所構(gòu)建的體外病理模型應(yīng)用到藥物評價的領(lǐng)域，具體涉及一種糖尿病治療藥二甲雙胍對微流控芯片構(gòu)建的糖尿病腎病模型的藥物評價方法。

背景技術(shù)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是嚴(yán)重影響人類健康的慢性疾病，主要表現(xiàn)為糖尿病性腎小球硬化癥，一種以血管損害為主的腎小球病變。二甲雙胍是T2DM首選一線用藥并占據(jù)口服藥物治療中的基石地位。其以原型經(jīng)腎代謝，本身并無腎毒性，嚴(yán)重腎功能衰竭時易在體內(nèi)蓄積，存在血乳酸水平升高的風(fēng)險。然而，有證據(jù)表明二甲雙胍除降糖外還具有降低尿白蛋白排泄率和保護(hù)腎功能的作用但具體機(jī)制并不清楚。目前對于糖尿病腎病藥物測試研究基于體外細(xì)胞培養(yǎng)或者體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)，然而動物實(shí)驗(yàn)昂貴耗時和常規(guī)二維培養(yǎng)仿真性差不能有效觀測細(xì)胞的具體藥物反應(yīng)。所以，成功構(gòu)建糖尿病腎病微環(huán)境的體外模型，對于疾病機(jī)制研究以及藥物篩選尤為關(guān)鍵。這里我們應(yīng)用微流控芯片技術(shù)建立的糖尿病腎病模型，研究二甲雙胍對高糖引起的腎小球損傷的保護(hù)作用可能分子機(jī)制。

微流控器官芯片技術(shù)又稱為器官微生理系統(tǒng)，是新興前沿交叉學(xué)科技術(shù)。以微流控技術(shù)為核心，在微尺度空間進(jìn)行細(xì)胞3D培養(yǎng)和動態(tài)流體操控，模擬特定器官的體內(nèi)生理微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)特定器官功能單元的重建，為體外器官結(jié)構(gòu)功能重建提供了新的策略和重要的技術(shù)平臺。更因其同細(xì)胞尺寸匹配、環(huán)境同生理環(huán)境相近、在時間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過靈活設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞功能研究等特點(diǎn)而成為新一代細(xì)胞研究的重要平臺。這里我們應(yīng)用微流控芯片技術(shù)面，結(jié)合微加工，組織工程技術(shù)等建立具有選擇性濾過功能的多細(xì)胞成分3D腎小球?yàn)V過屏障，在此模型上更能創(chuàng)新性的研究細(xì)胞的EMT行為，用來評價二甲雙胍藥物的相關(guān)作用機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是一種基于器官芯片的二甲雙胍對糖尿病腎病保護(hù)作用評價方法，本發(fā)明精確度高，易于通過靈活設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞功能研究，基于器官芯片技術(shù)構(gòu)建的糖尿病腎病模型用以研究二甲雙胍對高糖條件下腎小球的保護(hù)作用，可能涉及的細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)如：氧化應(yīng)激產(chǎn)物(ROS)生成量，細(xì)胞外緊密連接蛋白(ZO-1)表達(dá)，腎小球足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的上皮細(xì)胞的間質(zhì)化(EMT)行為。

本發(fā)明提供了一種可以直接觀察二甲雙胍對糖尿病腎病條件下腎小球細(xì)胞的動力學(xué)影響研究，觀察腎小球內(nèi)皮和足細(xì)胞遷移行為，遷移過程中蛋白表達(dá)，及上皮樣的形態(tài)變化。

一種器官芯片，該器官芯片基于微流控芯片技術(shù)，該器官芯片由上層帶結(jié)構(gòu)PDMS芯片10和下層無結(jié)構(gòu)PDMS芯片11通過不可逆封接鍵合；所述上層帶結(jié)構(gòu)PDMS芯片10包括細(xì)胞加樣池1，膠原加樣池2，培養(yǎng)基加樣池3，廢液回收池4，細(xì)胞出樣池5，細(xì)胞培養(yǎng)室6，培養(yǎng)基灌流室7，細(xì)胞球捕獲槽8，細(xì)胞遷移室9；所述細(xì)胞培養(yǎng)室6上端與細(xì)胞加樣池1相連，下端與細(xì)胞出樣池5相連；所述培養(yǎng)基灌流室7上端與培養(yǎng)基加樣池3相連，下端與廢液回收池4相連，所述培養(yǎng)基灌流室7與細(xì)胞遷移室9處交界面為細(xì)胞球捕獲槽8。

所述細(xì)胞培養(yǎng)室6和培養(yǎng)基灌流室7高度為200～300μm，細(xì)胞遷移室8高度為60～120μm。

所述細(xì)胞遷移室9灌注后膠原固化后，形成細(xì)胞捕獲槽8。

一種基于器官芯片的二甲雙胍對糖尿病腎病保護(hù)作用評價方法，采用本發(fā)明器官芯片，具體步驟如下：