[發(fā)明專利]核素125I標(biāo)記雙調(diào)控溶瘤腺病毒的方法及其對前列腺癌靶向治療的實驗研究方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811476838.2
• 申請日: 2018-12-04
• 公開（公告）號: CN109706175A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓從輝;郝林;史振鐸;韓曉曉
• 申請（專利權(quán)）人: 徐州市中心醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 南京正聯(lián)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32243
• 代理人: 王素琴

1.一種核素¹²⁵I標(biāo)記雙調(diào)控溶瘤腺病毒的方法及其對前列腺癌靶向治療的實驗研究方法，其特征在于：包括以下步驟，

S1、前列腺特異性抗原PSA啟動子的克隆與鑒定；

S2、hTERT/PSA雙調(diào)控增殖腺病毒載體RSOAds－h(huán)TERT/PSA的構(gòu)建及鑒定；

S3、核素¹²⁵I標(biāo)記hTERT/PSA雙調(diào)控增殖型溶瘤腺病毒構(gòu)建¹²⁵I－RSOAds－h(huán)TERT/PSA核素-溶瘤病毒標(biāo)記物；

S4、¹²⁵I－RSOAds－h(huán)TERT/PSA體外對激素非依賴性前列腺癌細胞的轉(zhuǎn)染效率、腫瘤殺傷效應(yīng)檢測；

S5、¹²⁵I－RSOAds－h(huán)TERT/PSA靶向治療前列腺癌抑瘤效應(yīng)、瘤微環(huán)境改變觀察。

2.如權(quán)利要求1所述的核素¹²⁵I標(biāo)記雙調(diào)控溶瘤腺病毒的方法及其對前列腺癌靶向治療的實驗研究方法，其特征在于：步驟S1具體為，

S11、前列腺特異性啟動子的基因PCR克隆與鑒定：根據(jù)美國NCBI Nucleotide獲得的序列(U37672.1)，設(shè)計擴增PSA啟動子引物，并分別引入NotI和SpeI酶切位點；從前列腺癌組織中提取基因組DNA，并以此為模板行PCR擴增出522bp大小PSA啟動子片段；用EcoR V酶切pUC57質(zhì)粒，將目的基因的PCR產(chǎn)物與pUC57載體酶切產(chǎn)物進行連接，篩選克隆，提取質(zhì)粒并測序確認(rèn)插入產(chǎn)物；將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pUC57-PSAp；

S12、PSA啟動子和hTERT啟動子生物活性測定：培養(yǎng)表達不同PSA及hTERT的前列腺癌細胞至對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)染含有PSA啟動子和hTERT啟動子的熒光素酶質(zhì)粒PGL3-PSA及hTERT，雙熒光素酶系統(tǒng)測定PSA啟動子和hTERT啟動子的生物活性。

3.如權(quán)利要求1所述的核素¹²⁵I標(biāo)記雙調(diào)控溶瘤腺病毒的方法及其對前列腺癌靶向治療的實驗研究方法，其特征在于：步驟S2具體為，

S21、hTERT/PSA雙調(diào)控增殖腺病毒載體RSOAds－h(huán)TERT/PSA的構(gòu)建：運用定點突變重疊聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)使腺病毒質(zhì)粒PQW1的E1A和E1B的啟動子缺失，并產(chǎn)生合適的酶切位點，將帶有相同酶切位點的hTERT啟動子和PSA啟動子連入PQW1載體中，得到雙調(diào)控增殖腺病毒載體RSOAds－h(huán)TERT/PSA；

S22、每組病毒均進行擴增和滴度測定。

4.如權(quán)利要求1-3任一項所述的核素¹²⁵I標(biāo)記雙調(diào)控溶瘤腺病毒的方法及其對前列腺癌靶向治療的實驗研究方法，其特征在于：步驟S3具體為，

S31、¹²⁵I標(biāo)記采用N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)作為氧化劑進行標(biāo)記，分別設(shè)定不同濃度的溶瘤病毒和NBS進行作用，以便確定最佳的標(biāo)記條件，分別考察¹²⁵I的用量、反應(yīng)時間、pH值、反應(yīng)體積對¹²⁵I－RSOAds－h(huán)TERT/PSA核素-溶瘤病毒標(biāo)記物標(biāo)記率的影響；

S32、標(biāo)記完成后采用凝膠柱層析法分離純化核素-溶瘤腺病毒標(biāo)記物；采用紙層析法測定¹²⁵I－RSOAds－h(huán)TERT/PSA標(biāo)記物不同時間的放射性純度，采用微孔濾膜過濾除菌，并將標(biāo)記物放4℃冰箱保存待用；

S33、¹²⁵I分別標(biāo)記雙調(diào)控溶瘤腺病毒完成預(yù)實驗，對最佳標(biāo)記方法、標(biāo)記條件、標(biāo)記率、外部條件包括溫度、時間與pH值對標(biāo)記成功的影響。