[發明專利]單體鏈霉親和素和高斯熒光素酶的融合蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201811473698.3
• 申請日: 2018-12-04
• 公開（公告）號: CN111269323B
• 公開（公告）日: 2022-02-22
• 發明（設計）人: 李靜;王佑富;鄭越;董宇亮;章文蔚;徐崇鈞
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造極創科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;C12N5/10;G01N33/82
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

一種單體鏈霉親和素和高斯熒光素酶的融合蛋白及其應用，該融合蛋白包括單體鏈霉親和素全長蛋白和高斯熒光素酶全長蛋白或持續發光突變體，單體鏈霉親和素全長蛋白與高斯熒光素酶全長蛋白或持續發光突變體通過柔性肽連接。本發明的融合蛋白能夠方便、特異性地識別生物素分子，并具有催化底物氧化發光的功能，便于檢測。相比于SA和anti?SA抗體聯用檢測生物素，這種融合蛋白不僅方便快速，還不會引起底物的聚集，而且只需一次表達純化即可得到融合蛋白，生產工藝簡單，有利于規模生產。該融合蛋白在DNA雜交、免疫檢測、生化診斷等領域具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種單體鏈霉親和素和高斯熒光素酶的融合蛋白及其應用。

背景技術

鏈霉親和素(streptavidin,SA)是Chaiet在1963年發現的，是Streptomycesavidinii菌在培養過程中分泌的產物。一條SA肽鏈中有159個氨基酸殘基，分子量為16.5kDa。完整的SA蛋白由4條SA多肽鏈組成，形成一個四聚體結構。每條多肽鏈都可以特異性地結合一個生物素(Biotin)分子，因此，1分子SA可以結合4分子的生物素。兩者之間的相互作用以非共價結合形式存在，親和力達到10^-15/M，比抗原抗體的結合常數高若干數量級，是自然界中存在的最穩定的蛋白與小分子間相互作用。兩者之間的強結合導致生物素和SA經常被用于開發標記和檢測的工具。應用時通常將生物素標記于待檢測的底物，用SA結合于標記在底物上的生物素，再用SA的抗體結合于SA，同時抗體上預先連接有發光基團，可被激發發光，最終通過檢測發光而檢測到底物。

SA和生物素之間1：4的結合比例可能引起生物素修飾的底物的聚集，在某些應用下帶來不必要的副效果。因此，有研究人員將鏈霉親和素和根霉親和素(另一種與鏈霉親和素結構類似，可以高效結合生物素的蛋白)的序列進行雜合，通過基因工程的手段開發出一種由一條肽鏈形成的單體鏈霉親和素(MonoSA)，可以1：1的比例結合生物素。MonoSA對生物素仍保持了較高的結合活性，達到10^-9/M，同時避免了底物聚集帶來的副作用。

熒光素酶是生物體內催化熒光素或脂肪醛氧化發光的一類酶的總稱。通常發現于低等動物體內。目前常用的熒光素酶有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶及高斯熒光素酶。螢火蟲熒光素酶發光需要ATP和Mg²⁺的輔助，海腎熒光素酶雖然不依賴于ATP和Mg²⁺等輔助因子，但發光強度較弱，應用時需要更靈敏的檢測。

高斯熒光素酶(gaussia luciferase,Gluc)很好地彌補了螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的缺點，發光時既不需要ATP和Mg²⁺等輔助因子，也有高于海腎熒光素酶100倍的發光效率。高斯熒光素酶是由一種海洋撓趾類動物分泌的熒光素酶，是目前發現的分子量最小的熒光素酶，并且具有信號肽，可以分泌到胞外，便于活性檢測。在氧氣存在的條件下，高斯熒光素酶可自發催化底物腔腸素氧化發光。發光強度是目前發現的熒光素酶中最高的，易于檢測。由于以上優點，高斯熒光素酶在活細胞檢測、蛋白與蛋白相互作用、蛋白定位、小干擾RNA沉默技術、高通量藥物篩選等領域中得到了廣泛的應用。

目前，利用MonoSA進行生物素標記的識別主要通過MonoSA和anti-MonoSA抗體的聯用。即用MonoSA特異性識別生物素，然后用帶有發光基團的anti-MonoSA抗體識別MonoSA，最終通過檢測抗體上的發光基團的發光來檢測生物素。這種方法過程繁瑣，耗時長。且如果使用的是SA和anti-SA抗體還有可能造成底物聚集。

發明內容

本發明提供一種單體鏈霉親和素和高斯熒光素酶的融合蛋白及其應用，該融合蛋白既可以特異性結合生物素也具備高強度自發光的能力，可以方便快速的檢測生物素標記的底物。