[發(fā)明專利]胚胎染色方法、判斷胚胎發(fā)育能力的方法及試劑盒

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• 申請日: 2018-12-04
• 公開（公告）號: CN109609583A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發(fā)明（設計）人: 郭勇;倪和民;齊曉龍;蔡德霖;王相國;盛熙暉;刑凱
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京匯知杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11587
• 代理人: 楊巍;蔡倫

1.一種胚胎染色方法，包括以下步驟：

a)采用活細胞染色劑對胚胎進行活細胞染色；并

b)采用死細胞染色劑對該胚胎進行死細胞染色。

2.根據權利要求1所述的胚胎染色方法，其中所述胚胎為來源于哺乳動物的胚胎，例如為來源于小鼠、大鼠、豬、牛、羊、或者靈長類動物如人的胚胎。

3.根據權利要求1或2所述的胚胎染色方法，其中在步驟a)中，所述活細胞染色劑為二乙酰熒光素(FDA)、DIO、13、24、newport green、亮甲酚藍，并且在步驟b)中，所述死細胞染色劑為碘化丙啶(PI)或7-氨基放線菌素D(7AAD)、疊氮溴化丙錠(PMA)、疊氮溴乙錠(EMA)。

4.根據權利要求1-3任一項所述的胚胎染色方法，其中所述胚胎為小鼠胚胎，在步驟a)中采用二乙酰熒光素(FDA)對該小鼠胚胎的活細胞進行染色，并且在步驟b)中采用碘化丙啶(PI)對該小鼠胚胎的死細胞進行染色。

5.根據權利要求4所述的胚胎染色方法，其中所述二乙酰熒光素(FDA)的工作濃度為3-5μg/mL，優(yōu)選為3.5μg/mL；所述碘化丙啶(PI)的工作濃度為3-10μg/mL，優(yōu)選為5μg/mL。

6.根據權利要求4或5所述的胚胎染色方法，其中所述二乙酰熒光素(FDA)染色持續(xù)0.5-2分鐘，優(yōu)選1分鐘；所述碘化丙啶(PI)染色持續(xù)3-10分鐘，優(yōu)選持續(xù)5分鐘。

7.根據權利要求1-6任一項所述的胚胎染色方法，其中在進行步驟a)之前，還額外地進行胚胎培養(yǎng)直至發(fā)育穩(wěn)定；具體地，在所述胚胎為小鼠胚胎時，采用KSOM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述KSOM包含0.8-1.2mg/ml、優(yōu)選1mg/ml的牛血清白蛋白，且還包含1-1.2mg/ml、優(yōu)選1.12mg/ml的乳酸鈉。

8.一種判斷胚胎發(fā)育能力的方法，包括以下步驟：

a)實施權利要求1-7任一項所述的胚胎染色方法；

b)用激發(fā)光照射經染色的胚胎，并拍攝圖像，然后根據獲得的圖像計算胚胎死細胞比率；并且

c)如果在步驟b)中獲得的胚胎死細胞比率在一個閾值以下，則判斷該胚胎能夠繼續(xù)發(fā)育，

如果在步驟b)中獲得的胚胎死細胞比率高于該閾值，則判斷該胚胎不能繼續(xù)發(fā)育。

9.根據權利要求8所述的方法，其中實施權利要求4-7任一項所述的胚胎染色方法，在步驟b)中用480nm-520nm的激發(fā)光照射，且步驟c)中所述的一個閾值為8.5％。

10.一種用于實施權利要求1-9任一項所述方法的試劑盒，包括：

a)活細胞染色劑，例如二乙酰熒光素(FDA)、DIO、13、24、newportgreen、亮甲酚藍；

b)死細胞染色劑，例如碘化丙啶(PI)、7-氨基放線菌素D(7AAD)、疊氮溴化丙錠(PMA)、疊氮溴乙錠(EMA)；以及

c)用于指導如何實施權利要求1-7任一項的胚胎染色方法的說明書或者用于指導如何實施權利要求8或9的判斷胚胎發(fā)育能力的方法的說明書。