[發明專利]一種HLC-BMP融合蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201811473280.2
• 申請日: 2018-12-04
• 公開（公告）號: CN109608551A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 陳卓玥;謝鑫;張楨;余源;崔繼紅;李紅民;陳富林
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/20;C07K1/18;C12N15/62;C12N15/63
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 王孝明

本發明公開了一種HLC?BMP融合蛋白及其制備方法，該融合蛋白的基因序列由以下三部分依次組成：HLC基因序列、柔性接頭和BMP基因序列。所述柔性接頭的氨基酸編碼序列包括(G)_n或(GGGGS)_n，其中n＝1～4。本發明的HLC?BMP融合蛋白在國內外尚屬首次，其優點為：(1)HLC?BMP融合蛋白為直接產物，可避免BMP與載體復合過程中失活；(2)BMP的釋放可通過設計融合蛋白編碼序列進行控制，從而提高BMP利用率。

技術領域

本發明涉及生物醫學材料領域，特別涉及一種HLC-BMP融合蛋白及其制備方法。

背景技術

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是廣泛存在于人和動物骨基質中的一種骨生長因子，于1965年首次被Urist發現，具有非種屬特異性，能夠跨種屬誘導成骨。目前，己克隆到15種BMP，其中除BMP1外其它均屬于TGF-β超家族。在所有BMP中，以BMP2和BMP7的誘骨活性最強，是已知最有效的促骨形成因子。將BMP與人工材料復合，成為具有骨誘導活性的人工骨修復材料以替代自體骨移植，是目前植骨材料研究領域的熱點。

類人膠原蛋白(human-like collagen，HLC)是根據膠原蛋白多肽鏈中“Gly-Pro-Hyp”、或“Gly-Pro-Xaa”和“Gly-Xaa-Yaa”(Xaa、Yaa代表Gly 和Pro以外的任何氨基酸)的重復序列，通過基因工程技術獲得的具有膠原蛋白特性的蛋白質。Myllyharju J等使用酵母表達出類人I、II、III型膠原蛋白。 Tang等在大腸桿菌中表達出類人I型膠原蛋白(GAPGAPGSQGAPGLQ)₁₆。

但目前類人膠原蛋白與BMP復合的方法仍主要是通過將膠原蛋白浸泡于 BMP溶液中使BMP與膠原蛋白結合，這種物理復合的方式導致BMP利用率不高。

發明內容

為解決上述問題，本發明的目的是提供一種利用基因工程技術制備的 HLC-BMP融合蛋白，該融合蛋白為基因工程直接表達產物，解決現有的膠原蛋白與BMP物理浸泡復合方法導致的BMP利用率不高的問題。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案予以實現：

一種HLC-BMP融合蛋白，該融合蛋白的基因序列由以下三部分依次組成：

HLC基因序列、柔性接頭和BMP基因序列，該融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

本發明還具有如下技術特征：

所述柔性接頭的氨基酸編碼序列包括(G)_n或(GGGGS)_n，其中n＝1～4。

所述融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、分別合成HLC編碼基因和碳端連接了柔性接頭的BMP編碼基因，并保存于克隆載體；

步驟二、通過核苷酸限制性內切酶切割、核酸瓊脂糖凝膠電泳和目的片段切膠回收，將HLC-BMP融合蛋白的編碼基因插入線性化表達載體，經轉化和重組子篩選鑒定，獲得HLC-BMP融合蛋白表達載體；

步驟三、實現HLC-BMP融合蛋白在宿主細胞中的過表達；

步驟四、純化過表達產物HLC-BMP融合蛋白，干燥保存。