[發明專利]一種HLC-BMP融合蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201811473280.2
• 申請日: 2018-12-04
• 公開（公告）號: CN109608551A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 陳卓玥;謝鑫;張楨;余源;崔繼紅;李紅民;陳富林
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/20;C07K1/18;C12N15/62;C12N15/63
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 王孝明

1.一種HLC-BMP融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白的基因序列由以下三部分依次組成：HLC基因序列、柔性接頭和BMP基因序列，該融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示。

2.如權利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述柔性接頭的氨基酸編碼序列包括(G)_n或(GGGGS)_n，其中n＝1～4。

3.如權利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、分別合成HLC編碼基因和碳端連接了柔性接頭的BMP編碼基因，并保存于克隆載體；

步驟二、通過核苷酸限制性內切酶切割、核酸瓊脂糖凝膠電泳和目的片段切膠回收，將HLC-BMP融合蛋白的編碼基因插入線性化表達載體，經轉化和重組子篩選鑒定，獲得HLC-BMP融合蛋白表達載體；

步驟三、實現HLC-BMP融合蛋白在宿主細胞中的過表達；

步驟四、純化過表達產物HLC-BMP融合蛋白，干燥保存。

4.如權利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述步驟一中，HLC包括(Gly-Xaa-Yaa)_n的60倍體、(Gly-Xaa-Yaa)_n的72倍體、(Gly-Xaa-Yaa)_n的84倍體或(Gly-Xaa-Yaa)_n的96倍體，其中Xaa、Yaa為Gly以外的任何氨基酸；所述BMP包括BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14或BMP-15中的任意一種。

5.如權利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述步驟二中，將HLC-BMP融合蛋白的編碼基因插入線性化表達載體包括：采用細菌表達時，將HLC-BMP編碼基因插入線性化的原核表達載體的相應位點，經細菌轉化和重組子篩選鑒定，獲得一系列氨基酸組成和肽鏈長度不同的HLC-BMP表達載體；采用真核表達時，將HLC-BMP編碼基因的克隆載體線性化，轉化真核細胞和重組子篩選鑒定，獲得一系列氨基酸組成和肽鏈長度不同的HLC-BMP表達載體。

6.如權利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述步驟二中，用于保存HLC-BMP融合蛋白的克隆菌株為原核細胞或真核細胞。

7.如權利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述步驟三中，實現HLC-BMP融合蛋白在宿主細胞中的過表達包括：采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳確定HLC-BMP融合蛋白為可溶性表達還是包涵體表達，對可溶性表達收集上清，對包涵體表達收集沉淀后用鹽酸胍或尿素溶解。

8.如權利要求3所述融合蛋白，其特征在于，所述步驟四中，純化表達產物HLC-BMP融合蛋白包括：確定HLC-BMP融合蛋白等電點后采用陰/陽離子交換層析或反相色譜法進行純化。

9.權利要求1所述HLC-BMP融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、分別合成HLC編碼基因和碳端連接了柔性接頭的BMP編碼基因，并保存于克隆載體；

步驟二、通過核苷酸限制性內切酶切割、核酸瓊脂糖凝膠電泳和目的片段切膠回收，將HLC-BMP融合蛋白的編碼基因插入線性化表達載體，經轉化和重組子篩選鑒定，獲得HLC-BMP融合蛋白表達載體并保存；

步驟三、實現HLC-BMP融合蛋白在宿主細胞中的過表達；

步驟四、純化表達產物HLC-BMP融合蛋白，干燥保存。

10.如權利要求9所述制備方法，其特征在于，所述步驟一中，HLC包括(Gly-Xaa-Yaa)_n的60倍體、(Gly-Xaa-Yaa)_n的72倍體、(Gly-Xaa-Yaa)_n的84倍體或(Gly-Xaa-Yaa)_n的96倍體，其中Xaa、Yaa為Gly以外的任何氨基酸；所述BMP包括BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14或BMP-15中的任意一種。