[發明專利]一種收集囊胚腔液體的方法

在審

• 申請號: 201811470251.0
• 申請日: 2018-11-28
• 公開（公告）號: CN109402220A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 曹祖兵;寧偉;劉洪瑜;高迪;許騰騰;王怡青;童旭;張丹丹;張運海
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12Q1/24
• 分類號: C12Q1/24
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 沈尚林

本發明公開了一種收集囊胚腔液體的方法，包括如下步驟：顯微操作針的準備，用拉針儀，斷針儀和磨針儀制作內徑為10μm的注射針以及針口為40μm的固定針，注射針要將針尖拔尖；囊胚腔液體的收集，在顯微操作儀下，用固定針固定住內細胞團一側，用注射針刺入囊胚腔中吸取囊胚腔中的液體至于1μLDPBS液滴中，收集完成后用較細的口吸針將囊胚腔中的液體轉移到進口200μL的離心管中；囊胚腔液體中DNA含量的檢測。這種收集方法采用自制的較細的注射針易刺破囊胚腔，對囊胚后續發育所產生的影響較小，且較為精準，可以收集單個囊胚腔中的液體，為胚胎植入前遺傳學篩查提供新的方法。

技術領域

本發明屬于細胞生物學領域，具體是一種收集囊胚腔液體的方法。

背景技術

胚胎著床前發育過程中，需要經過幾次卵裂、卵裂球致密化以及囊胚形成、擴張及孵化等階段，囊胚質量的高低決定了胚胎后續發育能力的潛力。囊胚主要是由兩種類型的細胞組成，體積較大而數量較少的細胞，稱為內細胞團，這種細胞將來發育成胎兒的各種組織和器官；而延透明帶內壁擴展和排列的，體積較小而數量較多的細胞，稱為滋養層細胞，這些細胞將來發育成胚膜和胎盤。囊胚質量是影響胚胎移植成敗的關鍵因素。因此，通過形態觀察、細胞或分子標記檢測技術來評價囊胚質量有助于提高動物胚胎移植后的妊娠率和出生率。在形態學上，囊胚內細胞團細胞數目以及這些內細胞團細胞結合的緊密程度，滋養層細胞是否由較多的細胞構成，細胞之間結合是否緊密，這些形態學觀察都是判定囊胚質量優劣的標準。此外，通過分析胚胎細胞數、胚胎代謝活性、染色體異常等也可以判定囊胚是否具有繼續發育的潛力。然而，這些檢測方法都是以損傷囊胚部分活性為代價的，這樣的囊胚移植后其發育能力將會顯著降低。

在人類生殖醫學中，傳統的胚胎植入前遺傳學篩查主要采用的樣本是卵裂期單個卵裂球1-2個或囊胚期滋養層細胞5-10個。這種通過取卵裂期或囊胚期單細胞進行胚胎植入前染色體篩查對胚胎后期的發育可能會有一定的影響。因此，發明一種對胚胎發育較安全的囊胚質量檢測方法顯得尤為重要。囊胚腔液體含有囊胚細胞分泌的一些DNA分子，某些DNA分子是評價囊胚質量高低的重要分子標記，因此通過評價囊胚腔液體中DNA分子含量的有無或高低可以間接反映囊胚質量，這是一種不會造成囊胚細胞數量降低的無侵害囊胚質量評估技術。鑒于囊胚體積非常小、含有的液體量也非常低，急需開發一種能夠準確收集囊胚腔液體的方法。本發明通過顯微操作技術將囊胚腔中的液體吸出，然后檢測囊胚腔液體中是否含有DNA來斷定此種方法的可行性，進而為檢測囊胚質量開辟一種新的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種收集囊胚腔液體的方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種收集囊胚腔液體的方法，包括如下步驟：

(1)顯微操作注射針制備：取鈍化好兩端的細玻管一支，安裝于拉針儀進行拉針，拉完針后，打開斷針儀，制得內徑為10μm的平口針，再進行磨針，使得針口磨成斜口，將磨好的針管進行斷針、彎針，使針尖彎曲20°備用；

(2)顯微操作固定針制備：將上述拉好的針管安裝在斷儀上斷針，斷好后針再進行彎針，使針管彎曲20°，將針卸下，置于針盒中備用；

(3)囊胚腔液體的收集

首先用顯微操作固定針將囊胚吸住，用顯微操作注射針撥動囊胚使內細胞團與顯微操作固定針針口緊貼，此時吸緊囊胚并用注射針穿過透明帶后扎進囊胚腔中，吸出囊胚腔中的液體并轉移到右側的1μL的DPBS中即可,盡量不要吸取到任何細胞物質。收集10枚囊胚腔中的液體，用較細的口吸針將混在1μL DPBS中的囊胚液吸出，放入到進口的200μL進口離心管中；

(4)將收集到的囊胚腔的液體進行DNA含量檢測。

優選地，步驟(1)中，拉針具體步驟為：