[發明專利]一種收集囊胚腔液體的方法

在審

• 申請號: 201811470251.0
• 申請日: 2018-11-28
• 公開（公告）號: CN109402220A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 曹祖兵;寧偉;劉洪瑜;高迪;許騰騰;王怡青;童旭;張丹丹;張運海
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12Q1/24
• 分類號: C12Q1/24
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 沈尚林

1.一種收集囊胚腔液體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)顯微操作注射針制備：取鈍化好兩端的細玻管一支，安裝于拉針儀進行拉針，拉完針后，打開斷針儀，制得內徑為10μm的平口針，再進行磨針，使得針口磨成斜口，將磨好的針管進行斷針、拔尖、彎針，使針管彎曲20°備用；

(2)顯微操作固定針制備：將上述拉好的針管安裝在斷針儀上斷針，斷好后針再進行彎針，使針管彎曲20°，將針卸下，置于針盒中備用；

(3)囊胚腔液體的收集：首先用顯微操作固定針將囊胚吸住，用顯微操作注射針撥動囊胚使內細胞團與顯微操作固定針針口緊貼，此時吸緊囊胚并用注射針穿過透明帶后扎進囊胚腔中，吸出囊胚腔中的液體并轉移到右側的1μL的DPBS中即可,盡量不要吸取到任何細胞物質，收集10枚囊胚腔中的液體，用較細的口吸針將混在1μL DPBS中的囊胚液吸出，放入到進口的200μL進口離心管中；

(4)將收集到的囊胚腔的液體進行DNA含量檢測。

2.根據權利要求1所述的收集囊胚腔液體的方法，其特征在于，步驟(1)中，拉針具體步驟為：打開拉針儀，調節拉針儀參數：P＝500，PULL＝200，VEL＝80，TIME＝100，取鈍化好兩端的細玻管一支，安裝于拉針儀，按下PULL鍵，系統運行結束后小心卸下拉好的針管，放入針盒以備集中進行斷針。

3.根據權利要求1所述的收集囊胚腔液體的方法，其特征在于，步驟(1)中，斷針具體步驟為：打開斷針儀開關，10×物鏡，調整玻璃針位置，將玻璃管尖端內徑10μm處與玻璃珠剛好接觸，將加熱旋鈕調整到35℃左右，踩下腳踏開關，當看到玻璃針和玻璃珠粘在一起,而且玻璃管尖端有變彎的傾向時，松開腳踏開關，由于降溫收縮，玻璃珠即可折斷玻璃管的尖端，從而得到了符合要求的內徑為10μm的平口針。

4.根據權利要求1所述的收集囊胚腔液體的方法，其特征在于，步驟(1)中，磨針具體步驟為：打開磨針儀開關，并將磨石上方注水管內放滿蒸餾水，用水浸濕磨石，調節磨石的轉速為30rpm，磨針角度定位在45°，將斷好的玻璃針管安裝到固定柄上，旋動粗準焦螺旋，使針尖快速下降，接近磨石時，換用細準焦螺旋，通過目鏡觀察，小心針尖落在磨石上，接觸磨石后，針管內液面上升，將細準焦螺旋再轉90°即可，持續1-2min后，即可將針口磨成斜口，將磨好的針管撤下。

5.根據權利要求1所述的收集囊胚腔液體的方法，其特征在于，步驟(1)中，拔尖和彎針具體步驟為：將磨好的針管安裝到斷針儀上，調節玻璃管和玻璃珠相對位置,避免操作時相互接觸，10×物鏡下將針豎起，使針尖位于玻璃珠上方，將加熱旋鈕調整到40℃左右，踩下踏板，用細螺旋使針尖落下，當針尖與玻璃珠接觸軟化后，迅速將針尖抬起，形成針尖后松開踏板，針尖長度為11-13μm，優選地，針尖長度為12μm，拔尖完成后，5×物鏡下將拔好尖的針置于玻璃珠左側同一平面內100μm管徑處，先使玻璃珠遠離針管，將加熱旋鈕調整到60℃，踩住踏板同時將玻璃球靠近針管，當針管彎曲至20°時，松開腳踏開關，撤下玻璃針。

6.根據權利要求1所述的收集囊胚腔液體的方法，其特征在于，步驟(2)中，顯微操作固定針制備具體步驟為：將上述拉好的針管安裝在斷針儀上，加熱旋鈕調到40℃，10×物鏡下于100μm處斷針，斷好后，將針豎起，針口置于玻璃球的上方，先使玻璃球遠離針口，將加熱旋鈕調節到60℃，踩下踏板，同時將針尖靠近玻璃球，當針縮口到40μm處且針口變平滑時松開踏板停止加熱，將固定針從豎起，5×物鏡下將拔好尖的針置于玻璃珠左側同一平面內100μm左右管徑處，針尖部朝下置于玻璃球左方，將加熱旋鈕調整到60℃踩下開關，使針管彎曲20°，將針卸下，置于針盒中備用。

7.根據權利要求1所述的收集囊胚腔液體的方法，其特征在于，步驟(3)中囊胚腔液體的收集之前，先將上述做好的顯微操作注射針以及固定針安裝在顯微操作儀上并調整好角度，放在0.25％的胰蛋白酶液滴中檢查固定針以及注射針使用是否正常，取一個潔凈的進口的35mm培養皿皿蓋，用預熱過的DPBS在皿蓋中間靠左側豎排做三個10μL DPBS液滴，在每個液滴的右側做一個1μL的液滴，用石蠟油蓋住DPBS液滴，用口吸針將第七天擴張囊胚移入中間一個10μL的DPBS液滴中，將顯微操作注射針抬起并將培養皿放在載物臺上，放下顯微操作注射針，將顯微操作注射針放在上方的10μLDPBS液滴中，清洗顯微操作注射針，避免顯微操作注射針中的胰蛋白酶對囊胚產生影響。