[發(fā)明專利]一種融合標(biāo)簽促進(jìn)Kuma030蛋白酶可溶性表達(dá)及非親和層析快速純化的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811468905.6
• 申請日: 2018-12-04
• 公開（公告）號: CN109517074A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 易犁;劉厚權(quán);喻嬋;張桂敏
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12N9/50;C12Q1/37
• 代理公司: 北京精金石知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11470
• 代理人: 強(qiáng)紅剛

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種融合標(biāo)簽促進(jìn)Kuma030蛋白酶可溶性表達(dá)及非親和層析快速純化的應(yīng)用，其是將融合表達(dá)策略與Kuma030蛋白酶自身性質(zhì)相結(jié)合，獲得了一種融合標(biāo)簽促進(jìn)Kuma030蛋白酶在大腸桿菌中可溶性表達(dá)并純化的方法，該方法不僅能夠促進(jìn)蛋白酶高表達(dá)，而且還可以得到移除融合表達(dá)標(biāo)簽的純蛋白，純度高的同時具有更加簡便、低耗的優(yōu)點(diǎn)，更適用于大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及融合標(biāo)簽促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)以及一種快速蛋白純化方法在Kuma030表達(dá)純化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

乳糜瀉(celiac disease,CD)是一種攜帶有遺傳易感基因的個體因攝入含麥膠蛋白(即麩質(zhì)gluten)的谷物(如小麥、大麥和黑麥，等)及其制品而引發(fā)的T細(xì)胞介導(dǎo)的系統(tǒng)性自身免疫病。Kumamolysin是一種可以降解麩質(zhì)中PQ序列的一種蛋白酶。該蛋白酶具有獨(dú)特的催化三聯(lián)體(Glu78-Asp82-Ser278)，屬于絲氨酸-羧基蛋白酶(S53)家族，且具有膠原蛋白酶活性。Kumamolysin蛋白酶由兩部分組成：氨基端-前導(dǎo)肽(188個氨基酸)和成熟結(jié)構(gòu)域(384個氨基酸)。當(dāng)Kumamolysin蛋白處于酸性環(huán)境下(pH<4.0)，會發(fā)生自我切割現(xiàn)象(Okubo et al.2006)，由非成熟的完整形式變成具有催化活性的成熟形式(以下簡稱為Af-Kuma030，37kDa)。野生型KumaWT(Kumamolysin)經(jīng)過兩次蛋白質(zhì)分子改造后得到高活性Kuma030突變體，其活性相對于野生型的KumaWT提高了800多倍。

2002年，Kumamolysin蛋白酶首次在大腸桿菌中克隆表達(dá)，但目標(biāo)蛋白產(chǎn)量非常低，需要進(jìn)一步濃縮之后才能在SDS-PAGE膠上檢測到明顯的條帶(Oyama et al.2002)。2003年，Naoki Tsuruoka等將ScpA蛋白(后來被證實(shí)為Kumamolysin蛋白)在大腸桿菌中表達(dá)，最終得到的純蛋白只有0.336mg/L(Tsuruoka et al.2003)。一方面，Kumamolysin蛋白在大腸桿菌中異源表達(dá)處于較低水平；另一方面，多步驟的非親和層析純化，例如陰陽離子交換、疏水作用等，使得最終純蛋白的得率很低。因此，迫切需要解決該蛋白在大腸桿菌中低水平表達(dá)以及純化產(chǎn)量低的問題。本發(fā)明人采用融合表達(dá)策略，利用能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解、折疊的融合標(biāo)簽蛋白與Kumamolysin蛋白串聯(lián)表達(dá)，使得蛋白產(chǎn)量提高到9.9mg/L。與此同時，發(fā)明人還采用一種快速高效的非親和層析兩步純化方法，極大的簡化了純化步驟，提高了產(chǎn)品得率，相比于現(xiàn)行的純化方法，更具大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的潛力。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于Kuma030蛋白直接在大腸桿菌中異源表達(dá)水平較低以及多步驟的純化方式，本發(fā)明提供了一種融合標(biāo)簽促進(jìn)Kuma030蛋白酶表達(dá)以及一種兩步純化法的應(yīng)用，能夠在顯著提高Kuma030蛋白酶表達(dá)量的同時，還能進(jìn)一步快速純化得到純蛋白。

隨著研究的深入，越來越多的融合表達(dá)標(biāo)簽被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、可溶性表達(dá)的作用。然而，本發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的眾多融合標(biāo)簽中，只有Sumo對Kuma030蛋白酶的表達(dá)具有明顯的促進(jìn)作用。另外，本發(fā)明人深入研究了Kuma030蛋白酶自身的性質(zhì)，意外發(fā)現(xiàn)其在65℃高溫、pH 4.0的環(huán)境中依然具有較高的活性。在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，酸性條件下，尤其是在pH不高于4.2時，Kuma030蛋白酶會進(jìn)行自我切割，移除前導(dǎo)肽部分，形成具有催化活性的成熟肽，在此過程中，能夠很好的移除位于目標(biāo)蛋白N端的融合表達(dá)標(biāo)簽。因此，發(fā)明人構(gòu)建了將具有促表達(dá)作用的融合標(biāo)簽Sumo序列連在Kuma030基因的N端的融合表達(dá)載體，在純化過程中進(jìn)行酸熱兩步處理時，一方面大量大腸桿菌內(nèi)源蛋白在低pH環(huán)境變性沉淀；另一方面，Kuma030在酸的作用下進(jìn)行自我切割，從而移除了在N端的融合標(biāo)簽，快速高效的得到了有活性的純蛋白。

基于上述研究結(jié)果，本發(fā)明人利用融合表達(dá)策略以及結(jié)合Kuma030蛋白酶自身特性，最終提供了一種融合標(biāo)簽促進(jìn)Kuma030蛋白酶表達(dá)以及二步非親和層析純化方式的應(yīng)用。具體的技術(shù)方案概況如下：