[發明專利]一種融合標簽促進Kuma030蛋白酶可溶性表達及非親和層析快速純化的應用

在審

• 申請號: 201811468905.6
• 申請日: 2018-12-04
• 公開（公告）號: CN109517074A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 易犁;劉厚權;喻嬋;張桂敏
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12N9/50;C12Q1/37
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 強紅剛

1.一種融合標簽促進Kuma030蛋白酶在大腸桿菌中可溶性表達并純化的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)通過三輪PCR擴增得到Sumo-Kuma030片段，其中第一輪PCR擴增得到Kuma030片段，第二輪PCR擴增得到融合標簽Sumo片段，第三輪通過連接PCR的方式將Sumo片段連接于Kuma030片段的N端，形成大片段Sumo-Kuma030；

(2)將步驟(1)獲得的PCR產物Sumo-Kuma030回收后，用限制性內切酶酶切，再將載體經過上述限制性核酸內切酶酶切后回收，與Sumo-Kuma030酶連，得到表達載體pKuma030-3(如圖1所示)；

(3)將表達載體pKuma030-3轉化到大腸桿菌感受態細胞中，挑取轉化子進行培養和誘導表達；

(4)表達后收集菌體，去掉上清，水洗后用pH 6.8-7.2、0.03-0.08M Tris-HCl緩沖液重懸菌體，加入溶菌酶，室溫靜置30-50min，超聲波破菌處理，離心破菌液，使破菌碎片與上清液完全分離，將上清液用HCl調pH至3.8-4.0，去除沉淀，離心收集上清液并于52-60℃水浴中處理20-30min，離心收集上清。

2.根據權利要求1所述融合標簽促進Kuma030蛋白酶在大腸桿菌中可溶性表達并純化的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的載體為pET28a。

3.根據權利要求1所述融合標簽促進Kuma030蛋白酶在大腸桿菌中可溶性表達并純化的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的限制性核酸內切酶為NcoⅠ和XhoⅠ。

4.根據權利要求1所述融合標簽促進Kuma030蛋白酶在大腸桿菌中可溶性表達并純化的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

5.根據權利要求1所述融合標簽促進Kuma030蛋白酶在大腸桿菌中可溶性表達并純化的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的Tris-HCl緩沖液的pH為6.8-7.2，濃度0.03-0.08M。

6.根據權利要求1所述融合標簽促進Kuma030蛋白酶在大腸桿菌中可溶性表達并純化的方法，其特征在于，步驟(4)中所述破菌處理的方式為超聲波破菌，超聲3s停6s，采用200-400W功率破菌8-12min。

7.根據權利要求1所述融合標簽促進Kuma030蛋白酶在大腸桿菌中可溶性表達并純化的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的水浴的溫度為52-60℃。

8.一種利用權利要求1所述方法表達并純化得到的Kuma030蛋白酶的活性檢測方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)設計蛋白多肽底物MBP-Substrate-6xHis-GST，其中Substrate的序列如序列表中的序列1所示；

(2)取純化得到的Kuma030蛋白酶與所述蛋白多肽底物，加入pH為3.8-4.0的醋酸鈉緩沖液中混合，在36-38℃水浴中反應10-60min；

(3)反應結束后，取樣用于SDS-PAGE檢測，電泳結果顯示為43kDa和26kDa兩條帶。