[發明專利]一種檢測HPV18 E7蛋白的單克隆抗體及其制備和應用

有效

• 申請號: 201811465944.0
• 申請日: 2018-12-03
• 公開（公告）號: CN109575130B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 常小迦;施麗君;鄭雅婷;時成龍
• 申請（專利權）人: 艾托金生物醫藥（蘇州）有限公司
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C12N15/13;G01N33/68;G01N33/577;C07K19/00;C12N15/85;A61K39/42;A61P35/00
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 張黎

本發明屬于生物醫藥領域，尤其涉及一種檢測HPV18 E7蛋白的單克隆抗體及其制備和應用。本發明最終得到特異性高、親和力強、能夠穩定表達且重復性良好的單克隆抗體，能特異性的識別HPV18 E7蛋白，具有用于制備防治宮頸癌、陰莖癌、會陰部癌、陰道癌、肛門癌及口咽部癌等癌癥的藥物的潛力。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，尤其涉及到一種檢測HPV18 E7蛋白的單克隆抗體及其制備和應用。

背景技術

HPV是一種小DNA病毒，具有很強的嗜鱗狀上皮的特性，主要侵犯鱗狀上皮的基底層細胞和位于宮頸轉化區的化生細胞。目前已知的HPV有一百多個型別，根據致癌性，分為高危型HPV和低危型HPV兩類。高危HPV感染(如16和18型)導致大多數宮頸、陰莖、會陰部、陰道、肛門及口咽部癌和癌前病變；而非致癌性、低危型的HPV感染(如6和11型)會導致生殖器疣和復發性呼吸道乳頭瘤樣增生。

宮頸癌是目前病因唯一明確的腫瘤，它是人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)持續感染的結果。癌癥發生過程中HPV DNA整合入人體細胞基因組內，轉化型細胞內開始持續表達HPV E6和E7蛋白。HPV E6蛋白通過E6-AP(E6 associated protein)的介導，結合并降解抑癌蛋白p53；HPV E7蛋白與抑癌蛋白pRb結合，使pRb釋放核轉錄因子E2F，致使細胞過度增殖，細胞周期調控失控，導致細胞的永生化并促進宮頸癌的發生。

高危HPV E7蛋白作為癌蛋白在宮頸癌(前)病變發生中的作用已經明確，然而由于HPV E7癌蛋白較低的免疫原性阻斷了其在宮頸癌檢測中的作用。關于HPV E7蛋白溶液結構的研究表明E7蛋白高度保守的N端是非結構化的，這可能是其免疫原性低的一個原因。并且高危HPV E7蛋白在細胞內的定位會隨著細胞融合的不同狀態而改變，即HPV E7蛋白在細胞內的分布處于一種動態，且HPV E7蛋白可處于胞質和胞核中。因此，特異性識別高危HPV E7蛋白的單克隆抗體較難獲得。本發明通過采用純化的GST-HPV18 E7重組蛋白免疫小鼠，同時通過ELISA檢測、免疫組化等實驗，最終得到一種特異性高、親和力強、能夠穩定表達且重復性良好的單克隆抗體，該抗體能夠特異性地檢測宮頸上皮癌(前)變細胞中位于細胞核內的HPV18 E7蛋白。

發明內容

本發明針對現有技術中存在的問題，提供一種能特異性識別HPV18 E7蛋白的單克隆抗體，而與其他蛋白無交叉反應，顯著提高了HPV18 E7蛋白檢測的特異性、準確性和可靠性，真實反映細胞核內HPV18 E7蛋白的表達水平，可應用于制備防治宮頸癌、陰莖癌、會陰部癌、陰道癌、肛門癌及口咽部癌等癌癥的藥物的潛力。

本發明的第一方面，提供了一種單克隆抗體，所述單克隆抗體的重鏈可變區包含：氨基酸序列為SEQ ID NO：1-3所示的HCDR；所述單克隆抗體的輕鏈可變區包含：氨基酸序列為SEQ ID NO：4-6所示的LCDR；

進一步的，所述單克隆抗體為人源、鼠源、兔源或嵌合抗體；

進一步的，所述單克隆抗體的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述單克隆抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；

更進一步的，所述單克隆抗體為特異性抗HPV的抗體；優選地，所述單克隆抗體為特異性抗HPV18的抗體；更優選地，所述單克隆抗體為特異性抗HPV18 E7蛋白的抗體，且該蛋白定位在細胞核中。

本發明第二方面，提供了一種重組蛋白，所述重組蛋白包含本發明第一方面中任一所述的單克隆抗體，以及任選的協助表達和/或純化的標簽序列；

進一步的，所述的標簽序列包括6x His標簽；