[發(fā)明專利]杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811459796.1
• 申請(qǐng)日: 2018-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109402166B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顧連峰;馬祥慶;高鵬飛;席飛虎;魏文桃;陳凱;胡凱強(qiáng);劉博;張航曉;趙良真
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12Q1/6851;C12Q1/6895;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明提供了杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)及其構(gòu)建方法，屬于林木基因工程領(lǐng)域。包括如下步驟：杉木植株材料的培養(yǎng)；目的基因片段的克隆；重組病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建；農(nóng)桿菌介導(dǎo)沉默載體侵染杉木植株；沉默效果結(jié)果驗(yàn)證。使用本發(fā)明可以根據(jù)植株表型的變化來(lái)探究目標(biāo)基因的功能機(jī)制，該VIGS體系的建立對(duì)林木裸子植物功能基因的研究具有開(kāi)創(chuàng)性的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于林木基因工程領(lǐng)域，具體涉及杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

杉木（Cunninghamia lanceolata）杉木科杉木屬，是主要生長(zhǎng)在我國(guó)南方區(qū)域的特有林種。杉木具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其樹(shù)體筆直，木材結(jié)構(gòu)均勻，材質(zhì)堅(jiān)硬。在很多方面杉木都具有使用價(jià)值，是很好的建筑材料，在造船，家具制造等也有廣泛的使用。但是林木的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系困難，目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，因此開(kāi)發(fā)出快速有效的對(duì)杉木的基因功能研究的技術(shù)體系具有重要意義。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-Induced Gene Silencing，VIGS）是用于快速產(chǎn)生基因敲除表型的非常有用的研究工具，其可用于評(píng)估植物基因功能。VIGS利用RNA病毒的感染激活了一種基于RNA的保守植物抗病毒防御反應(yīng)，該反應(yīng)針對(duì)通過(guò)感染病毒產(chǎn)生的RNA進(jìn)行序列特異性降解。通過(guò)將目的基因序列片段插入病毒載體中，該內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄物成為降解的靶標(biāo)，從而導(dǎo)致目的基因的表達(dá)量顯著下調(diào)或敲低。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）已被證明是研究草本植物物種中基因功能的有效工具，但很少在林木上進(jìn)行測(cè)試。建立快速可靠的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)于木本植物尤為重要，研究難點(diǎn)在于許多植物難以進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在這項(xiàng)研究中，我們首次在林木裸子植物杉木中成功建立植物的病毒誘導(dǎo)基因沉默VIGS系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)及其構(gòu)建方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)：通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)攜帶目的基因片段的重組病毒質(zhì)粒侵染杉木所得。

一種杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

（1）杉木植株材料的培養(yǎng)：在溫室條件下種植，挑選種粒飽滿質(zhì)地均勻的種子，撒播處理培養(yǎng)30~60天，子葉打開(kāi)2-3cm。

（2）目的基因片段的克隆：選擇杉木待研究基因，以待研究基因靠近3’端UTR區(qū)域300bp至350bp范圍內(nèi)核苷酸序列作為目標(biāo)基因片段，設(shè)計(jì)目的基因片段的正反向引物，以杉木基因組DNA為模板，利用高保真酶PCR擴(kuò)增，獲得目的基因片段。

（3）重組病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建：病毒載體pTRV2與獲得的目的基因片段相連接，獲得pTRV2和目的基因片段相連接的重組病毒質(zhì)粒,然后將重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌。

（4）農(nóng)桿菌介導(dǎo)重組病毒質(zhì)粒侵染杉木植株：將含有pTRV1的農(nóng)桿菌菌液與含有重組病毒質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液按照1:1的體積比混勻，然后使用1mL注射器采用注射的方法侵染杉木。

（5）沉默效果結(jié)果驗(yàn)證：侵染的杉木植株60~70天后逐漸出現(xiàn)表型，觀察植株的表型變化，使用半定量RT-PCR做基因表達(dá)分析，觀察目標(biāo)基因的表達(dá)量變化情況，使用酶標(biāo)儀測(cè)量杉木植株的葉綠素含量變化。

進(jìn)一步的，上述目的基因片段的克隆：待研究基因?yàn)樯寄景藲浞鸭t素脫氫酶（phytonene desaturase,PDS）基因，其基因序列如SEQ ID NO:1所示；目的基因片段的系列如SEQ ID NO:2所示；目的基因片段的正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示。