[發(fā)明專利]杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811459796.1
• 申請(qǐng)日: 2018-11-30
• 公開（公告）號(hào): CN109402166B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顧連峰;馬祥慶;高鵬飛;席飛虎;魏文桃;陳凱;胡凱強(qiáng);劉博;張航曉;趙良真
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12Q1/6851;C12Q1/6895;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

1.一種杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)，其特征在于：通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)攜帶目的基因片段的重組病毒質(zhì)粒侵染杉木所得；

包括如下步驟：

（1）杉木植株材料的培養(yǎng)：在溫室條件下種植，挑選種粒飽滿質(zhì)地均勻的種子，撒播處理培養(yǎng)30~60天，種莢打開子葉完全伸展打開2-3cm；

（2）目的基因片段的克隆：選擇杉木目標(biāo)基因，以目標(biāo)基因靠近3’端UTR區(qū)域300bp至350bp核苷酸序列作為目標(biāo)基因片段，設(shè)計(jì)目的基因片段的正反向引物，以杉木基因組DNA為模板，利用高保真酶PCR擴(kuò)增，獲得目的基因片段；

（3）重組病毒質(zhì)粒的構(gòu)建：病毒載體pTRV2與獲得的目的基因片段相連接，獲得pTRV2和目的基因片段相連接的重組病毒質(zhì)粒，然后將重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌；

（4）農(nóng)桿菌介導(dǎo)重組病毒質(zhì)粒侵染杉木植株：將含有pTRV1的農(nóng)桿菌菌液與含有重組病毒質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液按照1:1的體積比混勻，然后使用1mL注射器采用注射的方法侵染杉木；

（5）沉默效果結(jié)果驗(yàn)證：侵染的杉木植株60~70天逐漸出現(xiàn)表型，觀察植株的表型變化，使用半定量RT-PCR做基因表達(dá)分析，觀察目標(biāo)基因的表達(dá)量變化情況，使用酶標(biāo)儀測(cè)量杉木植株的葉綠素含量變化；

所述目的基因片段的克隆：目標(biāo)基因?yàn)樯寄綪DS基因，其基因序列如SEQ ID NO:1所示；目的基因片段的序列如SEQ ID NO:2所示；目的基因片段的正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)，其特征在于，所述重組病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建，是以Gateway方法構(gòu)建重組病毒質(zhì)粒載體，其中入門載體為pDONR207，終載體pTRV2病毒載體279；重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌所用農(nóng)桿菌菌株為GV3101。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)，其特征在于，所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)重組病毒質(zhì)粒侵染杉木植株，包括以下步驟：

1）取l mL含有重組病毒質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)接于6 mL含終濃度為50mg/mL利福平和終濃度為50mg/m L卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，28°C，220 rpm震蕩陪養(yǎng)使OD₆₀₀為 0.8；

2）將l mL步驟（1）所得菌液移至l.5 mL離心管中保菌，剩余菌液3800 rpm離心8 min，棄上清液；用懸浮液懸浮沉淀，然后用懸浮液凋整菌液濃度至OD₆₀₀ = 0.6；

3）將含有pTRV1的農(nóng)桿菌菌液分別與含有pTRV2和重組病毒質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液按照1：1的體積比混勻，室溫靜止放置4h后侵染杉木植株，其中含有pTRVI與含有pTRV2農(nóng)桿菌的混勻菌作為不含重組病毒質(zhì)粒的空載體對(duì)照；

4）用lmL的無(wú)針頭注射器吸取菌液，緩慢注射杉木子葉，以葉面充滿侵染液為準(zhǔn)，接種后16℃黑暗培養(yǎng)16h；取出放置25℃,光照培養(yǎng)16h,再轉(zhuǎn)至黑暗培養(yǎng)8h培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)，其特征在于，說(shuō)述懸浮液的組成為：10mM MES，10 mM MgCl₂，200 μM AS。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)，其特征在于，所述半定量RT-PCR做基因表達(dá)分析，以actin基因作為半定量分析的內(nèi)參對(duì)照，檢測(cè)PDS基因全長(zhǎng)的表達(dá)量情況；PDS基因全長(zhǎng)正向引物如序列SEQ ID NO:5所示，反向引物如序列SEQ ID NO:6所示；actin內(nèi)參基因的正向引物如序列SEQ ID NO:7所示，反向引物如序列SEQ ID NO:8所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種杉木病毒誘導(dǎo)基因沉默系統(tǒng)，其特征在于，測(cè)量葉綠素時(shí)，用于葉綠素提取測(cè)的混合液為：丙酮、無(wú)水乙醇和蒸餾水按4.5 :4.5 :1的比例配制而成。