[發(fā)明專利]一種能實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)復(fù)合肽的scAAV及方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811455838.4
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109536462A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊廣孝;王全穎
• 申請（專利權(quán)）人: 楊廣孝;王全穎
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/62;C12N15/63;A61K38/16;A61P35/00;A61P3/10;A61P9/10
• 代理公司: 成都眾恒智合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51239
• 代理人: 劉華平

本發(fā)明公開了一種能實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)復(fù)合肽的scAAV及方法和應(yīng)用，解決現(xiàn)有技術(shù)中基因治療效應(yīng)性底下問題，解決了腫瘤和疑難疾病基因治療效應(yīng)和安全性兼顧問題。本發(fā)明的一種能實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)復(fù)合肽的scAAV，包含信號肽?人工內(nèi)含子?第一表達(dá)肽?拼接序列1?拼接序列2?第二表達(dá)肽?拼接序列3?第三表達(dá)肽?順反子重組表達(dá)盒；或者包含信號肽?第一表達(dá)肽?(GGGGS)₃(柔性連接子?第二表達(dá)肽?柔性連接子?第三表達(dá)肽?終止子的融合表達(dá)盒)。本發(fā)明通過柔性連接子分泌表達(dá)融合復(fù)合肽的scAAV技術(shù)，在同一重組病毒聯(lián)合分泌表達(dá)了2種以上的治療肽，它克服了基因治療效應(yīng)性低下問題，解決了心腦血管疾病基因治療效應(yīng)和安全性兼顧問題，為基因治療創(chuàng)立新的方法學(xué)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)復(fù)合肽的scAAV及方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

肽屬于蛋白質(zhì)分子的功能區(qū)序列，無論是抗原-抗體相互作用，還是激素和受體的結(jié)合及配體和受體相互作用，都是肽的和蛋白或非肽物質(zhì)結(jié)合，引起的激動或阻抑作用，因此我們認(rèn)為蛋白和非蛋白相互作用都是功能肽肽完成的。雖然在不同學(xué)科和領(lǐng)域，有多種多樣的名子，但肽的理化作用機(jī)制是相同的。因?yàn)殡牡姆肿有。瑵B透能力強(qiáng)，合成費(fèi)用低，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。但是短肽在原核和真核細(xì)胞內(nèi)被酶降解，也是不能表達(dá)成功的。化學(xué)合成肽隨著長度增加費(fèi)用加大，而且肽的穩(wěn)定性差，體內(nèi)半活期短，因此臨床使用困難。見于肽類藥物生產(chǎn)和使用困難，國外科學(xué)家使用非肽化合物取代肽類藥方法來解決肽類藥物生產(chǎn)和臨床應(yīng)用問題，目前已經(jīng)有易瑞薩和特羅凱等絡(luò)氨酸酶抑制劑經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)用于臨床治療腫瘤，當(dāng)然也有許多酶抑制劑，如血管緊張素酶1和2的抑制劑用于治療高血壓。使用現(xiàn)代隨機(jī)肽文庫和噬菌體文庫發(fā)現(xiàn)確定和蛋白質(zhì)相互作用的肽序列，已經(jīng)成為常規(guī)方法，但是使用非肽化合物來代替生物活性肽的機(jī)能還是件復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和機(jī)能相關(guān)關(guān)系問題，因?yàn)榉请幕衔锖碗慕Y(jié)構(gòu)不同，體內(nèi)分揀和配置就不一樣，使用非肽可能帶來對細(xì)胞，組織和機(jī)體毒副作用，就P53而言替代N端15肽的Nutlin已經(jīng)成功了十幾年，但它抗腫瘤作用不如P53N端15肽，在使用短肽治療惡性腫瘤研究中最近使用化學(xué)合成藥替代生物肽，基本原理是依據(jù)肽的和靶點(diǎn)間作用結(jié)構(gòu)，使用化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化學(xué)物質(zhì)，通常通過藥物設(shè)計軟件，推測幾種可能具有肽樣生物活性，合成后通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)它的活性和安全性和體內(nèi)藥物代謝的動力學(xué)，如P53蛋白最早合成了Nutliny和抑制MDM2和MDM4的化合物如附圖5、6所示。

雖然化學(xué)合成藥替代肽已經(jīng)發(fā)表大量文章，取得重要進(jìn)展，如它可以適合大生產(chǎn)和質(zhì)量控制。但是作為化學(xué)合成非肽類藥，和生物活性肽結(jié)構(gòu)不同，體內(nèi)代謝動力學(xué)等毒負(fù)反應(yīng)不一致。大量的研究還處于臨床前狀態(tài)。但應(yīng)當(dāng)看到使用合成非肽物質(zhì)替代肽類藥物可能是具有前景的。

生物活性肽，機(jī)能和穩(wěn)定性還有缺欠，使用化學(xué)和基因添加輔助序列和結(jié)合蛋白增添必需機(jī)能，如膜滲透，靶向序列和標(biāo)簽序列是非常重要的。目前對GLP-1的修飾和血清白蛋白結(jié)合，大大提高了它的穩(wěn)定性，使它藥效學(xué)增強(qiáng)，使它血清半活期明顯延長，是近年在肽類藥物應(yīng)用重大進(jìn)展。治療腫瘤短肽需要添加靶向和穿膜序列和必要的架構(gòu)展示序列保證腫瘤殺傷能力。因此使用短肽腫瘤腫瘤不但是活性肽的選擇，更要注重分泌表達(dá)和靶向滲透入胞的工程設(shè)計。除了腫瘤的復(fù)雜基因，RNA和蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)和代謝紊亂之外，一些疾病也存在類似問題。如老年癡呆一方面同Aβ細(xì)胞沉積有關(guān)也同細(xì)胞內(nèi)Aβ的寡聚體形成相關(guān)，也同神經(jīng)元的凋亡，Tau蛋白纏結(jié)相關(guān)，因此治療藥的使用不能是單一蛋白質(zhì)或DNA和RNA物質(zhì)，它應(yīng)當(dāng)是針對各個紊亂組合體，就肽類物質(zhì)而言就是復(fù)合肽的協(xié)同表達(dá)才能更好改變病理和認(rèn)知障礙。我們使用了可以清除細(xì)胞外老年斑的scFv抗Aβ(1-42肽)抗體同時使用ABAD-Dp 來清除細(xì)胞內(nèi)Aβ(1-42肽)寡聚體，同時為了阻斷神經(jīng)元的凋亡，使用神經(jīng)保護(hù)肽NAP和 BDNF受體loop2的結(jié)合肽和神經(jīng)細(xì)胞線粒體保護(hù)肽Humanin,這樣才能夠恢復(fù)老年癡呆轉(zhuǎn)基因小鼠的病理和認(rèn)知。所以說多靶點(diǎn)的復(fù)合肽治療的有效性和安全性是良好的，這好像艾滋病使用一種抗病毒藥常常是無效的，但是何大一教授使用雞尾酒療法挽救許多艾滋病人的生命并且一些病人可以自主生活。