[發明專利]一種體外高效擴增培養細胞毒性T淋巴細胞的方法

在審

• 申請號: 201811454732.2
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109504657A
• 公開（公告）日: 2019-03-22
• 發明（設計）人: 袁衛平;周麗英;汪曉敏;呂為;萬謙
• 申請（專利權）人: 溯源生命科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 陳娟

1.一種體外高效擴增培養細胞毒性T淋巴細胞的方法，且特征在于：具體步驟為：

步驟一：配置培養基，每1mL X-VIVO 15無血清培養基內含IL-2 1000IU，包被培養瓶，用50g/mL CD3預處理T225cm²帶有空氣濾膜的細胞培養瓶，4℃包被過夜后，備用；

步驟二：取樣，取100mL靜脈血，其中活率≥90％，用于制備單個核細胞，取等量淋巴細胞分離液，小心轉移靜脈血至分離液之上，輕柔操作避免打破交界液面，采用離心機進行離心，在1800×rpm離心15min，小心吸取中間白膜層，即單個核細胞層，轉移至新離心管中；

步驟三：單個核細胞用生理鹽水浸泡，采用離心機進行離心在1800×rpm，離心10min，充分漂洗3遍；

步驟四：將分離獲得的單個核細胞用一定體積的X-VIVO 15無血清培養基培養，無血清培養基培養中內含IL-2，終濃度1000IU/mL，按1-2.0×10⁶個/mL的濃度接種于包被過的T225cm²細胞培養瓶中，細胞培養瓶中內含CD3，終濃度50g/mL，放置在37℃下，在5％±0.5％CO₂的飽和濕度的培養箱內培養；

步驟五：第4天向T225cm²細胞培養瓶中補入步驟二中等體積X-VIVO 15無血清培養基，無血清培養基內含IL-2，終濃度1000IU/mL，做好標記，放入CO₂培養箱中繼續培養；

步驟六：第6天，觀察培養基顏色并計數，向T225cm²細胞培養瓶中補入150mL 37℃預熱的X-VIVO 15無血清培養基，無血清培養基內含IL-2，終濃度1000IU/mL，混勻，放入CO₂培養箱中繼續培養；

步驟七：第7天擴增培養，培養瓶內細胞處于1.0×10⁶個/mL左右時最適宜進行擴增操作，數量過低應將培養瓶放回培養箱，繼續培養，取出細胞培養瓶，表面消毒，放入生物安全柜中，用移液器輕輕吹打細胞，混勻，均分至5個T225cm²細胞培養瓶中，每瓶補足37℃預熱的X-VIVO 15無血清培養基，無血清培養基內含IL-2，終濃度1000IU/mL，至200mL，混勻，放入CO₂培養箱中培養；

步驟八：第13天向5個細胞培養瓶中補入37℃預熱的X-VIVO 15無血清培養基，無血清培養基內含IL-2，終濃度1000IU/mL，至200mL，混勻，放入CO₂培養箱中培養；

步驟九：第20天收獲細胞，收集5瓶細胞培養物，在室溫下，采用離心機在1500rpm下，離心10min；

步驟十：計數，取少量細胞，稀釋至200倍，可收獲細胞數量約為3-4×10⁹個；

步驟十一：利用流式細胞術檢測CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、CD4⁺CD25⁺細胞比例，此類細胞為細胞毒性T淋巴細胞，利用無血清凍存液凍存該細胞于液氮中。