[發(fā)明專利]一種體外高效擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811454732.2
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109504657A
• 公開（公告）日: 2019-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁衛(wèi)平;周麗英;汪曉敏;呂為;萬謙
• 申請（專利權(quán)）人: 溯源生命科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京科家知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427
• 代理人: 陳娟

本發(fā)明公開了一種體外高效擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法，涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。具體步驟為：配置培養(yǎng)基，取樣，單個(gè)核細(xì)胞用生理鹽水浸泡，采用離心機(jī)進(jìn)行離心后充分漂洗3遍；將分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)，第20天收獲細(xì)胞，收集5瓶細(xì)胞培養(yǎng)物，在室溫下，采用離心機(jī)在1500rpm下，離心10min；計(jì)數(shù)，取少量細(xì)胞，稀釋至200倍，可收獲細(xì)胞數(shù)量約為3?4×10⁹個(gè)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、CD4⁺CD25⁺細(xì)胞比例，此類細(xì)胞為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，具有取材容易、對機(jī)體損傷小、少量外周血可獲取大量的具有高活性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞、適宜大規(guī)模培養(yǎng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種體外高效擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

肝病與腫瘤，在我國均屬于高發(fā)疾病，據(jù)保守估計(jì)，中國乙肝病毒感染者約9000萬，其中僅慢性患者就有2800萬；丙肝病毒感染者760萬(慢性患者456萬)。而每年死于肝炎導(dǎo)致的肝硬化和原發(fā)性肝癌者有33萬，惡性腫瘤對人類的威脅日益突出，已經(jīng)成為我國城鄉(xiāng)居民的第一位死因。城市中，我國常見癌癥死亡率前5位的依次是肺、肝、胃、食管和大腸；農(nóng)村中依次是胃、肝、食管、肺和大腸。腫瘤特異性免疫治療的研究持續(xù)發(fā)展過程中，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞因?qū)δ承┎《尽⒛[瘤細(xì)胞等抗原物質(zhì)具有殺傷作用而被研究者們發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)，亦叫TC細(xì)胞(cytotoxic T cell)，是白細(xì)胞的亞群，為一種特異T細(xì)胞，專門分泌各種細(xì)胞因子參與免疫作用。與自然殺傷細(xì)胞構(gòu)成機(jī)體抗病毒、抗腫瘤免疫的重要防線。Helmich等人的研究表明，CTL無論在體外，還是在體內(nèi)正常生理狀態(tài)下，都能夠?qū)Ρ磉_(dá)與其TCR匹配的抗原的腫瘤有明顯的殺傷效果。CTL來自骨髓淋巴樣造血干細(xì)胞，有骨髓遷移至胸腺完成其成熟過程，成為初始CTL。初始CTL進(jìn)入外周淋巴組織，識別有抗原呈遞細(xì)胞(APC)提呈的抗原肽MHC-I類分子復(fù)合物，活化為CTL前體細(xì)胞(pCTL)。pCTL經(jīng)細(xì)胞表面分子如白細(xì)胞分化抗原28(CD28)、CD2、極遲抗原4(VLA4)、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(LFA1)等APC表達(dá)的共刺激分子如B7-1(CD80)、細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子(VACM-1)等結(jié)合，促使其進(jìn)一步分化成效應(yīng)CTL。

效應(yīng)CTL分泌穿孔素(PFP)與顆粒酶，PFP貯存于CD8⁺T細(xì)胞胞漿顆粒中，是CD8⁺T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的主要毒性蛋白。CD8⁺T細(xì)胞與靶細(xì)胞上特異的MHC-I和抗原的復(fù)合物識別后，或受到IL-2等刺激的情況下，細(xì)胞激活，發(fā)生脫顆粒(含有穿孔素、顆粒酶等)，釋放穿孔素。穿孔素在細(xì)胞膜上形成不同孔徑的跨膜孔道，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞膜去極化。Na⁺、H₂O經(jīng)過通道進(jìn)入胞內(nèi)，一些電解質(zhì)和大分子物質(zhì)流出胞外，改變細(xì)胞膜滲透壓，最終引起靶細(xì)胞滲透性死亡。穿孔素還可以通過顆粒酶促進(jìn)靶細(xì)胞凋亡而殺傷靶細(xì)胞。顆粒酶是外源性的絲氨酸蛋白酶，來自細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTLs)和自然殺傷細(xì)胞(NK)釋放的細(xì)胞漿顆粒。這些顆粒含有顆粒酶原及其它蛋白酶原，包括穿孔蛋白。由于CTL細(xì)胞與靶細(xì)胞結(jié)合(經(jīng)靶細(xì)胞表面的CTL受體和MHC分子的抗原結(jié)合)，顆粒的內(nèi)容物釋放，顆粒酶進(jìn)入了靶細(xì)胞，穿孔蛋白進(jìn)入了靶細(xì)胞通過在細(xì)胞膜的聚合形成了靶細(xì)胞膜的小孔，使細(xì)胞膜穿孔，最后穿孔蛋白使顆粒酶的膜穿孔引起顆粒酶的釋放。在細(xì)胞漿內(nèi)，顆粒酶B能通過三種不同的途徑激起細(xì)胞的死亡，首先激起Caspases的鏈鎖反應(yīng)，引起靶細(xì)胞DNA降解活動，然后裂解。CTL通過Fas/Fas-L誘導(dǎo)凋亡在生理病理性的細(xì)胞死亡以及CTL快速殺傷靶細(xì)胞的效應(yīng)途徑中同樣占有重要作用。TNF-α、INF-γ和LT等途徑介導(dǎo)的直接細(xì)胞毒作用和分泌細(xì)胞因子間接地特異性殺傷靶細(xì)胞。Fas及其配體Fas-L是近年來研究得最為深入的有關(guān)細(xì)胞凋亡的膜表面分子，它們在凋亡中作用機(jī)制的闡明，對深入了解細(xì)胞凋亡的機(jī)理及相關(guān)轉(zhuǎn)化研究起產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。