[發明專利]一種hiPSCs來源的類自閉癥模型的建立方法

在審

• 申請號: 201811453643.6
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN111254107A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 秦建華;崔康莉;王亞清
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C12N5/071;C12N5/079
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

1.一種hiPSCs來源的類自閉癥模型的建立方法，其特征在于該方法主要步驟分為：

(1)微柱陣列芯片的制備；

(2)在芯片上誘導類腦；

(3)在誘導階段初期VPA處理3D類腦。

2.按照權利要求1所述一種hiPSCs來源的類自閉癥模型的建立方法，其特征在于：所述微柱陣列芯片是由芯片外圍壩結構包圍微柱結構形成；用于類器官的生長,微柱結構的直徑為500-1000微米，高度為500-100微米，微柱間距為50-100微米，四個微柱結構圍成的區域為類腦的形成區域。

3.按照權利要求1所述一種hiPSCs來源的類自閉癥模型的建立方法，其特征在于：步驟(1)高通量微柱陣列芯片的制備，具體為步驟為：

(1)使用軟蝕刻技術制備SU-8模板，此模板為高通量凹陷小坑，之后對模板進行低粘附修飾，保證SU-8模板與PDMS聚合物容易分離；

(2)制作高通量陣列微柱結構的PDMS聚合物芯片：將PDMS與引發劑184按照體積比10～14：1混成均勻相，之后澆注到SU-8模板上，抽真空去除泡沫，置于80℃烘箱固化20-120分鐘，常溫將帶有結構的PDMS芯片與SU-8模板分離，得到高通量的微柱陣列PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周邊用相當大小的石英環將結構封閉，放于80℃烘箱內加熱至凝固，得到微陣列芯片。

4.按照權利要求1所述一種hiPSCs來源的類自閉癥模型的建立方法，其特征在于：微柱陣列芯片必須無菌，需要將制備好的芯片放于高溫滅菌鍋滅菌待用。

5.按照權利要求1所述一種hiPSCs來源的類自閉癥模型的建立方法，其特征在于：步驟(2)在芯片上誘導3D類腦，具體為：

(1)使用高通量的小坑芯片產生擬胚體：坑狀結構置于24孔板中，小坑芯片結構直徑為600-800微米，深度為100-300微米，用于制備擬胚體的形成；

(2)制備擬胚體階段，將融合度為70％-80％的hiPSCs消化成單細胞，一個六孔板里面加1.5ml含有ROCK inhibitor Y27632的mTeSR1培養基，之后置于24孔板中用于擬胚體的形成；

所述含有ROCK inhibitor Y27632的mTeSR1培養基中：ROCK inhibitor Y27632的母液與mTeSR1培養基的體積比為1：5000；

所述的ROCK inhibitor Y27632在母液中的濃度為30mM；

(3)將形成的擬胚體轉移至高通量微柱芯片，并加含有ROCK inhibitor Y27632以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培養基培養3天，3天之后加入含有bFGF以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培養基；

所述含有ROCK inhibitor Y27632以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培養基培中：ROCKinhibitor Y27632的母液與KSR培養基的體積比為1:2000；Dorsomorphine的母液與KSR的體積比為1:4000；A83-01的母液與KSR的體積比為1:4000；

所述含有bFGF以及Dorsomorphine、A83-01的KSR培養基中：bFGF的母液與KSR培養基的體積比為1:25000，Dorsomorphine的母液與KSR的體積比為1:4000；A83-01的母液與KSR的體積比為1:4000；

所述ROCK inhibitor Y27632在母液中的濃度為30mM；

所述Dorsomorphine在母液中的濃度為10mM；

所述A83-01在母液中的濃度為10mM；

所述bFGF在母液中的濃度為100ug/ml；

(4)到第6天時換成含有bFGF的NIM培養基，3天后換成不含bFGF的NIM培養基，加兩天；所述含有bFGF的NIM培養基中：bFGF的母液的體積與NIM培養基的體積比為：1:25000；

所述bFGF在母液中的濃度為100ug/ml。