[發明專利]一種hiPSCs來源的類自閉癥模型的建立方法

在審

• 申請號: 201811453643.6
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN111254107A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 秦建華;崔康莉;王亞清
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C12N5/071;C12N5/079
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

本發明涉及一種hiPSCs來源的類自閉癥模型的建立方法，該方法主要步驟為(1)微柱陣列芯片的制備；(2)在芯片上誘導類腦；(3)在誘導階段初期VPA處理3D類腦。該方法主要將干細胞與組織工程相結合，產生了3D類腦組織，通過施加符合生理濃度的VPA(丙戊酸鈉)，模擬有雙向情感障礙或癲癇的孕婦服用VPA之后對胎兒腦發育的影響，以此來探究自閉癥發生的病理機制。該模型是一種新型的自閉癥的體外模型，在可以觀察到VPA對胎兒腦發育的形態學變化的同時，可以借助分子生物學等多種手段來探究VPA增加胎兒自閉癥風險的致病機制。這樣可以消除動物實驗帶來的種屬差異以及細胞實驗的簡單以及2D條件的不足，為探究自閉癥的發生提供了一種新的模型與思路。

技術領域

本發明屬于器官芯片技術，具體涉及一種hiPSCs來源的類自閉癥模型的建立方法。

背景技術

自閉癥是廣泛性發育障礙的一種亞型，起病于嬰幼兒期，主要表現為不同程度的言語發育障礙、人際交往障礙、興趣狹窄和行為方式刻板。孕期服用VPA會增加胎兒患自閉癥的風險。目前對自閉癥的研究大都集中在動物模型或二維細胞體外模型。由于小鼠與人之間的種屬差異，以及2D培養的簡單性，亟待需要一種3D的人源模型。近幾年來包括神經干細胞、腸干細胞、胚胎干細胞以及iPSCs來源的類器官得到了有效發展。類器官的特點在于：通過重塑成人干細胞的器官再生或多能干細胞的器官發育，可以準確地代表器官的組織學和生理學。其中體外hiPSCs來源的3D腦基本復制了胎兒早期腦發育的過程，并且這一技術已經廣泛的用于構建疾病模型，包括小頭癥，以及寨卡病毒感染等等。

目前看來，類器官技術還有其不足以及需要改進的地方。由于類器官是3D的細胞團結構使得內部組織容易缺乏氧氣和營養，出現細胞死亡，因此限制體外器官的發育。基于此，需要結合其他技術來解決這一問題。此外，使用現有的傳統細胞培養技術培養類器官操作復雜，消耗時間長，可控性差。通過微流控技術制備的微柱陣列芯片有利于類腦組織的氣體交換與營養交換，除此之外微流控技術還可以提供更加符合生理的因素，例如流體等。

基于此，我們利用高通量的微柱芯片在施加流體的情況下，產生了3D腦類器官，并在特定的時期施加VPA以此來探究VPA增加自閉癥的致病機制。

發明內容

本發明的目的是建立一種生命早期類自閉癥體外模型，該方法使用微流控芯片產生3D類腦器官，不僅可以提供流體，而且小柱的結構有利于類腦器官之間的氣體與營養交換，我們可以實時動態監測，類腦器官的發育，同時探究VPA對類腦器官的形態學、分子以及細胞水平的影響，以此探究VPA增加自閉癥風險的致病機制。

本發明提供了一種hiPSCs來源的類自閉癥模型的建立方法，其步驟主要分為三部分：

(1)高通量微柱芯片的制備；

(2)在芯片上產生腦類器官；

(3)在誘導階段初期VPA處理3D類腦；

所述的微柱陣列芯片是由芯片外圍壩結構包圍微柱結構形成；可用于類器官的生長,微柱結構的直徑為500-1000微米，高度為500-100微米，微柱間距為50-100微米，四個微柱結構圍成的區域為類腦的形成區域。

步驟(1)高通量微柱陣列芯片的制備，具體為：

(1)使用軟蝕刻技術制備SU-8模板，此模板為高通量凹陷小坑，之后對模板進行低粘附修飾，保證SU-8模板與PDMS聚合物容易分離；

(2)制作高通量陣列微柱結構的PDMS聚合物芯片：將PDMS與引發劑184按照體積比10～14：1混成均勻相，之后澆注到SU-8模板上，抽真空去除泡沫，置于80℃烘箱固化20-120分鐘，常溫將帶有結構的PDMS芯片與SU-8模板分離，得到高通量的微柱陣列PDMS芯片；

(3)在PDMS芯片周邊用相當大小的石英環將結構封閉，放于80℃烘箱內加熱至凝固，得到微陣列芯片。