[發(fā)明專利]利用p5126-ZmMs1D構(gòu)建體創(chuàng)制玉米顯性核雄性不育系及其育種制種應(yīng)用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811451837.2
• 申請(qǐng)日: 2018-11-30
• 公開（公告）號(hào): CN109504703B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬向元;張丹鳳;謝科;吳鎖偉;安學(xué)麗;張煜文;侯全璨;劉欣潔;李金萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京首佳利華科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/65;C12N5/10;A01H1/02;A01H5/00;A01H5/10;A01H6/46
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1.一種介導(dǎo)玉米雄性生育力的顯性核雄性不育構(gòu)建體，其特征在于，該構(gòu)建體包含三種類型基因表達(dá)盒：(a)第一種表達(dá)盒，為導(dǎo)致玉米顯性核雄性不育的基因表達(dá)盒，其特征在于：該表達(dá)盒由花粉特異表達(dá)的玉米5126啟動(dòng)子、雄花發(fā)育基因ZmMs1基因和農(nóng)桿菌章魚堿合酶基因的終止子可操作地相連，其序列如SEQ ID NO.1所示；(b)第二種表達(dá)盒，為標(biāo)記玉米種皮顏色的表達(dá)盒，其特征在于：該表達(dá)盒由玉米種皮特異表達(dá)的Ltp2啟動(dòng)子、玉米種皮顏色標(biāo)記基因-紅色熒光基因DsRed和胭脂堿合成酶基因終止子可操作地相連，其序列如SEQ ID NO.2所示；(c)第三種表達(dá)盒，為除草劑抗性基因表達(dá)盒，其特征在于：該表達(dá)盒由花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子、除草劑抗性基因和花椰菜花葉病毒的35S polyA終止子可操作地相連，其序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一種用于創(chuàng)制包含權(quán)利要求1所述構(gòu)建體的玉米顯性核雄性不育植株的方法，所述方法包括：(a)提供第一植株；(b)創(chuàng)制第二植株，所述第二植株是向上述第一植株中引入權(quán)利要求1所述構(gòu)建體，且所述構(gòu)建體只存在于玉米同源染色體的其中一條染色體上，即所述構(gòu)建體為半合子狀態(tài)，該植株表現(xiàn)為不依賴于其背景基因型的顯性核雄性不育；(c)用所述第一植株的雄性配子給所述第二植株受精，以保持并產(chǎn)生50％所述第二植株基因型的后代。

3.一種用于繁殖含有權(quán)利要求1所述構(gòu)建體的玉米顯性核不育系種子的方法，所述方法包括：(a)通過權(quán)利要求2所述的第一植株作為父本為第二植株作為母本異花受精；(b)產(chǎn)生50％的含有所述構(gòu)建體的種子，為轉(zhuǎn)基因的顯性核雄性不育系種子；(c)產(chǎn)生50％非轉(zhuǎn)基因的正常可育保持系種子。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其還包括鑒定具有所述構(gòu)建體的植株的方法，其特征在于，所述鑒定具有所述構(gòu)建體的植株的方法具體為：(a)種植權(quán)利要求2所述第二植株與第一植株異花授粉產(chǎn)生的50％含有所述構(gòu)建體的紅色熒光轉(zhuǎn)基因顯性核不育種子；(b)使所述種子長(zhǎng)成待鑒定植株；(c)用除草劑噴灑所述待鑒定植株，具有所述構(gòu)建體的植株與不含所述構(gòu)建體的植株相比，沒有植物損傷癥狀或具有的損傷癥狀程度更輕。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其還包括鑒定具有所述構(gòu)建體的種子的方法，其特征在于，所述鑒定具有所述構(gòu)建體的種子的方法具體為：權(quán)利要求2所述第二植株與第一植株異花授粉產(chǎn)生的種子，在正常光下直接觀察，50％的種子呈現(xiàn)出淡紅色，為含有所述構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因顯性核不育系種子，在綠色激發(fā)光下通過紅色熒光濾鏡觀察，含有所述構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因顯性核不育系種子呈現(xiàn)出較強(qiáng)的紅色熒光；而另外50％的種子在正常光下和綠色激發(fā)光下均為正常的玉米種子顏色。

6.一種利用含有權(quán)利要求1所述構(gòu)建體的玉米顯性核不育系進(jìn)行雜交育種的方法，所述的方法具體為：(a)種植權(quán)利要求3所述的含有所述構(gòu)建體的玉米轉(zhuǎn)基因顯性核不育系種子，以及其它不同遺傳背景的玉米常規(guī)自交系種子；(b)在玉米開花、散粉期，利用上述的顯性核不育系植株作為母本，以其它玉米常規(guī)自交系作為父本進(jìn)行人工雜交，獲得F1雜交種；(c)在正常光下觀察該F1雜交種的顏色，約50％表現(xiàn)出淡紅色，為轉(zhuǎn)基因核雄性不育雜交種，如果在綠色激發(fā)光源下通過紅色熒光濾鏡觀察，轉(zhuǎn)基因雜交種表現(xiàn)出更強(qiáng)的紅色熒光；而另外50％F1雜交種無論在正常光下還是綠色熒光下觀察，均為正常玉米種子顏色，無熒光，為非轉(zhuǎn)基因可育雜交種；(d)該F1雜交種一方面可以作為轉(zhuǎn)基因品種直接混合測(cè)試和雜交組合品比，可育雜交種和不育雜交種自由授粉，不影響產(chǎn)量；也可通過色選機(jī)，選擇50％無紅色熒光的非轉(zhuǎn)基因的可育雜交種進(jìn)行測(cè)試和品比。

7.一種利用含有權(quán)利要求1所述構(gòu)建體的玉米顯性核不育系進(jìn)行雜交制種的方法，所述的方法具體為：(a)顯性核不育系為母本，通過回交轉(zhuǎn)育，定向改良和創(chuàng)制不同遺傳背景的含有所述構(gòu)建體的玉米轉(zhuǎn)基因顯性核不育母本系；(b)在制種田中，上述的顯性核不育母本系種子及其常規(guī)父本自交系種子按照行數(shù)比5:1種植，進(jìn)行自由授粉，后期拔除或提前收獲父本系，獲得顯性核不育母本系上的F1雜交種；(c)在正常光下觀察該F1雜交種的顏色，約50％表現(xiàn)出淡紅色，為轉(zhuǎn)基因雄性不育雜交種，如果在綠色激發(fā)光源下通過紅色熒光濾鏡觀察，轉(zhuǎn)基因雄性不育雜交種表現(xiàn)出更強(qiáng)的紅色熒光；另外50％F1雜交種無論在正常光還是綠色熒光激發(fā)下均表現(xiàn)為正常的玉米種子顏色，無熒光，為非轉(zhuǎn)基因可育雜交種；(d)該F1雜交種一方面可以作為轉(zhuǎn)基因品種直接混合種植，可育雜交種和不育雜交種自由授粉，不影響玉米產(chǎn)量；另一方面，可通過色選機(jī)，選擇50％無紅色熒光的非轉(zhuǎn)基因的可育雜交種進(jìn)行推廣應(yīng)用。