[發(fā)明專利]一種鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811450039.8
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109557321A
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發(fā)明（設計）人: 施振旦;陳蓉;朱歡喜
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業(yè)科學院
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 楊文晰

本發(fā)明公開一種鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA檢測方法，屬于生物技術領域的免疫學檢測方法；本發(fā)明以抗原親和純化的催乳素抗體為捕獲抗體，生物素標記的催乳素抗體為檢測抗體，鵝催乳素重組蛋白為標準品，建立了一種檢測鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA方法；該方法易于操作，靈敏度高，重復性好，能夠準確檢測鵝血漿中催乳素濃度的變化，彌補了國內外水禽催乳素檢測方法的不足。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域的免疫學檢測方法，具體涉及一種鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA檢測方法。

背景技術

催乳素(Prolactin,PRL)是一種主要由動物垂體前葉嗜酸性細胞分泌的蛋白質激素。在哺乳動物中，PRL的主要作用是促進乳腺發(fā)育，刺激并維持泌乳。在禽類中，PRL的主要作用是促進和維持就巢，以及感受光周期調節(jié)禽類的季節(jié)性繁殖。

PRL的定量檢測方法包括生物學測定方法和免疫學測定方法。生物學測定方法包括鴿嗉囊促進實驗、兔泌乳促進實驗和Nb2型淋巴細胞增殖實驗等。雖然生物學測定方法能夠檢測具有生物學活性的PRL含量，但是其檢測限高、重復性差、耗時長。免疫測定方法則利用了抗原-抗體反應，其特異性強，靈敏度高。其中，放射免疫法(RIA)的靈敏度比酶聯(lián)免疫法(ELISA)高，但其缺點也十分明顯，如同位素標記有效期短、損害實驗人員健康和危害環(huán)境等。化學發(fā)光和電化學發(fā)光法的靈敏度優(yōu)于RIA法和ELISA法，但其需要的儀器昂貴，且都為針對人PRL開發(fā)的封閉系統(tǒng)，限制了它的廣泛使用。因此，ELISA法因其靈敏度高，簡單快速，重復性較好，避免了RIA法的缺點，受到眾多實驗室的歡迎。

目前，國內外許多廠商開發(fā)了分別適用于人類以及鼠、豬、羊、牛和雞等動物的PRLELISA試劑盒，但是缺乏適用于水禽如鴨和鵝的PRLELISA試劑盒。雖然雞和鴨、鵝PRL蛋白之間的氨基酸序列同源性較高，但是將雞PRL ELISA試劑盒應用于水禽PRL的定量檢測，目前尚無文獻報道。目前市場上銷售的一些鴨和鵝PRLELISA檢測試劑盒，其檢測靈敏度無法驗證，且不能實現(xiàn)鵝PRL的定量檢測。此外，這些商品化試劑盒中所使用的PRL標準品大多是從動物垂體中提取的天然PRL蛋白，其提取純化的工藝步驟復雜、難度大、產量低，使得目前的試劑盒售價均高昂。

成熟的人PRL蛋白是由199個氨基酸殘基組成的多肽，分子量為23kD。但是，正常人的血清中存在著多種形式的PRL異構體，分子量主要為16，22，23，48和56kD。這些不同分子量的PRL異構體是由PRL轉錄產物的可變剪接，翻譯后修飾(如糖基化和磷酸化)以及多聚體化等原因造成的，其對于PRL生理功能的發(fā)揮具有重要作用。已有文獻報道，以兔抗雞PRL多克隆抗體為檢測抗體，在雞和鵝垂體提取物中均發(fā)現(xiàn)了從20-45kD范圍內5種不同分子量的PRL異構體，這表明在雞和鵝體內也存在著多種PRL異構體。因此，在開發(fā)禽類PRL的ELISA檢測方法時，抗PRL抗體是否能夠特異性識別多種PRL異構體是至關重要的。目前，文獻報道的兔抗雞PRL多克隆抗體是采用雞垂體提取的天然PRL蛋白作為抗原獲得的。由于動物體內天然蛋白的提取困難，通常采用基因工程技術生產的重組蛋白作為替代品來獲得抗PRL抗體。目前，基因工程技術多采用原核蛋白表達系統(tǒng)生產重組蛋白，該重組蛋白不存在翻譯后修飾，與天然蛋白相似度較低。隨著對水禽卵泡發(fā)育和產蛋調控技術等研究的深入，迫切需要開發(fā)一種適用于測定水禽PRL的ELISA檢測方法。

發(fā)明內容

針對上述問題，本發(fā)明利用基因工程技術制備鵝PRL重組蛋白，并通過制備相應的高特異性抗體，建立了一種具有靈敏度高、特異性強、準確、方便操作的鵝PRL雙抗體夾心ELISA檢測方法，本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的：

一種鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于，以鵝PRL多克隆抗體為捕獲抗體，生物素標記PRL抗體為檢測抗體，鵝PRL重組蛋白作為標準品，進行ELISA定量檢測；所述鵝PRL重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。