[發明專利]一種鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA檢測方法

在審

• 申請號: 201811450039.8
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109557321A
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發明（設計）人: 施振旦;陳蓉;朱歡喜
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 楊文晰

1.一種鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于，以鵝PRL多克隆抗體為捕獲抗體，生物素標記PRL抗體為檢測抗體，鵝PRL重組蛋白作為標準品，進行ELISA定量檢測。

2.根據權利要求1鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于，所述鵝PRL重組蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據權利要求1鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于，所述鵝PRL多克隆抗體制備方法如下：首先利用鵝PRL重組蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔獲得含有兔抗鵝PRL多克隆抗體的抗血清，然后對獲得的含有兔抗鵝PRL多克隆抗體的抗血清進行親和層析純化，獲得鵝PRL多克隆抗體。

4.根據權利要求1鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于，所述生物素標記PRL抗體是通過如下方法獲得的：利用碳酸氫鈉緩沖液將鵝PRL多克隆抗體稀釋至1mg/mL，獲得抗體溶液；然后每1mL抗體溶液中加入120μl N-羥基琥珀酰亞胺生物素溶液，室溫、避光條件下持續攪拌90min；再加入 NH₄Cl溶液終止反應；將反應液置于10mM PBS緩沖液中透析后，即獲得生物素標記PRL抗體。

5.如權利要求1-4任一所述鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于，所述以鵝PRL多克隆抗體為捕獲抗體，生物素標記PRL抗體為檢測抗體，鵝PRL重組蛋白作為標準品，進行ELISA定量檢測是指：

1）用PBS緩沖液將鵝PRL多克隆抗體稀釋至5μg/mL，加入酶標板中，4℃孵育過夜；次日棄去液體，加入含有質量百分數為5% 牛血清白蛋白的PBST溶液，37℃孵育1h；再次棄去液體，PBST溶液洗板，備用；

2）標準品檢測：

用PBST溶液將鵝PRL重組蛋白梯度稀釋后，加入步驟1）獲得的酶標板中，37℃孵育0.5h，棄去反應液，PBST溶液洗板，備用；

3）待測樣本檢測：

用PBST溶液將待測樣本稀釋至標準品濃度范圍內，加入步驟1）獲得的酶標板中，37℃孵育0.5h，棄去反應液，PBST溶液洗板，備用；

4)用PBST溶液將生物素標記PRL抗體稀釋至0.14μg/mL，分別加入步驟2）和步驟3）獲得的酶標板中，37℃孵育1h后，PBST溶液洗板；

5)用PBST溶液將鏈霉親和素-過氧化物酶結合物按照體積比1:12000稀釋后，加入步驟4）獲得的酶標板中，37℃孵育0.5h；棄去反應液，PBST溶液洗板；

6)加入TMB顯色液，37℃孵育10min后，加入1M鹽酸；然后置于酶標儀上讀取450nm處的OD值；

以PRL標準品濃度為橫坐標，以OD值為縱坐標，繪制標準曲線并建立回歸方程，回歸方程為y=0.1396x+0.0224，R²=0.99；

然后將待測樣本的OD值帶入所述回歸方程，即獲得待測樣本中鵝催乳素濃度。

6.根據權利要求5所述鵝催乳素的雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于，步驟2）所述梯度稀釋是指，將鵝PRL重組蛋白依次稀釋至濃度為0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5ng/mL。