[發明專利]一對特異性鑒別寬體金線蛭的引物

在審

• 申請號: 201811449817.1
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109504782A
• 公開（公告）日: 2019-03-22
• 發明（設計）人: 劉杰;鄭健;過立農;高妍;昝珂;李文靜;李麗瀟;黃濤宏
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 張秋燕

本發明公開了一種用于鑒定寬體金線蛭的特異性引物對，由引物KT?5’和引物KT?3’組成，所述引物KT?5’和所述引物KT?3’均為單鏈DNA分子，核苷酸序列依次為序列表中的序列1和序列2。采用該特異性引物對待測樣品的基因組DNA進行PCR擴增，如果能夠實現有效擴增，則所述待測樣品中含有或候選含有寬體金線蛭；如果不能實現有效擴增，則所述待測樣品中不含有或候選不含有寬體金線蛭。本發明能有效得將寬體金線蛭與其他水蛭樣品進行區分，快速、簡便。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及鑒別寬體金線蛭的特異性引物對和方法、應用。

背景技術

水蛭(HIRUDO)別名馬蛭、麻黃蜞、馬蟥，屬環節動物門蛭綱醫蛭形亞目醫蛭科。《神農本草經》記載：“水蛭主逐惡血、瘀血，月閉、破血瘕積聚……”，作為中藥,迄今已有3000多年的歷史。現代中醫學認為水蛭屬活血化瘀藥下屬分類的活血調經藥，可以抑制血小板的釋放、降低血脂、抑制成纖維細胞增殖；用于防治血栓疾病、控制癌癥細胞轉移與增值等。水蛭的功效與其抗凝血作用密切相關，其中最重要的、療效最好的抗凝血活性物質是水蛭素(Hirudin)，它是迄今為止世界上最有效和最安全的天然凝血酶抑制劑，與胰島素、青蒿素被稱為拯救人類疾病的“世界三素”，具有極高的藥用價值。

2015版《藥典》規定用于藥用的水蛭為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigra Whitman(即寬體金線蛭)、水蛭Hirudo nippponica whitman(即日本醫蛭)或柳葉螞蟥Whitmaniaacranulata Whitman(即尖細金線蛭)。值得注意的是，世界上的水蛭有500多種，我國有97種，它們分屬于不同的目、科和屬，在形態結構、取食習性、生活環境以及體內所含生物活性物質的結構和功能方面都是十分不相同的。發明人對我國安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蘄春幾個主要中藥材市場銷售的水蛭以及近十種水蛭中成藥的原料作了調查發現，中藥水蛭的資源極度緊缺；同時，水蛭的生產和貿易缺乏行業規范，來源混亂，存在著嚴重的相似品種水蛭品種混淆用藥問題。不同品種、療效有差異的水蛭品種混用影響水蛭中藥材質量，也給臨床用藥帶來極大的安全隱患。為了臨床用藥安全、準確和有效，針對外形相近的不同中藥材品種建立一種有效準確的鑒定方法成為已經成為迫在眉睫的需求。

隨著分子生物學迅速發展，DNA水平上的多樣性研究取得突破性進展，用于藥用的動植物的分子鑒定技術也日漸完善。肖凌等(水蛭DNA鑒定、活性多肽分離及其作用機制的研究，湖北中醫藥大學，2015年)擴增得到寬體金線蛭、菲牛蛭、日本醫蛭、尖細金線蛭、光潤金線蛭、棒紋牛蛭、日本山蛭及八目石蛭等8個物種的ITS2、COⅠ、12Sr RNA、16Sr RNA等基因片斷的序列，比較此4個基因片斷候選序列種內種間差異；得到12Sr RNA為醫用蛭類較為合適的DNA條形碼序列。CN2014101625452以DNA條形碼技術鑒定寬體金線蛭，通過對標準目的基因的DNA序列測定與比對分析，根據與理論序列的相似性進行判定的物種鑒定技術。但這種方法在檢測過程中遲遲沒有推廣起來，該方法存在著判定標準不嚴格、實際應用性不強等限制。具體原因主要有以下三個方面：一是過程復雜，耗時費力。DNA條形碼實驗需要經過提取DNA、聚合酶鏈式反應(PCR)，PCR產物電泳驗證、委托測序以及測序結果的手工校對、序列拼接、與公開序列進行比對等諸多步驟，不適用于快速、高通量的應用檢測。二是，結果穩定性較差，序列測定步驟復雜，測序反應的結果收到樣品前處理與反應條件的影響而質量不一，影響物種判定結論。三是，缺乏明確的判定標準，通常如果目標基因與所述理論基因序列SEQ ID NO.1的同源性在99％以上，即可判斷待測樣品的物種。但是，根據基因不同，待測物種不同，序列在物種間的變異程度是不相同的。因此，缺乏一個穩定、準確、清晰的同源性標準進行判定。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術存在的不足而提供一種鑒別寬體金線蛭特異性引物對，有效得將寬體金線蛭與其他水蛭樣品進行區分，快速、簡便。

本發明為解決上述提出的問題所采用的技術方案為：