[發(fā)明專利]一種核桃組織培養(yǎng)再生體系構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811447129.1
• 申請日: 2018-11-29
• 公開（公告）號: CN109302988A
• 公開（公告）日: 2019-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王小宇;王露
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西玉林玖旺農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01C1/08
• 代理公司: 玉林市振盛專利商標代理事務(wù)所 45109
• 代理人: 盧翔飛

本發(fā)明公開了一種核桃組織培養(yǎng)再生體系構(gòu)建方法，核桃又名為胡桃，是世界四大堅果之一。主產(chǎn)歐州、亞州等國，核桃稱益智果、長壽果，養(yǎng)人之寶，已經(jīng)為越來越多人所推崇。核桃的藥用價值很高，中醫(yī)應(yīng)用廣泛。醫(yī)學認為核桃性溫、味甘、無毒，有健胃、補血、潤肺、養(yǎng)神等功用。通過無性快繁技術(shù)獲得株性穩(wěn)定核桃種苗的技術(shù)方法。本發(fā)明以核桃未成熟胚為外植體，經(jīng)過種子消毒、胚愈傷組織誘導、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟構(gòu)建了核桃組織培養(yǎng)再生體系，既解決核桃優(yōu)質(zhì)種苗缺乏的問題，又可為今后開展核桃遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種核桃組織培養(yǎng)再生體系構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

核桃又名為胡桃，是世界四大堅果之一。主產(chǎn)歐州、亞州等國，核桃稱益智果、長壽果，養(yǎng)人之寶，已經(jīng)為越來越多人所推崇。核桃的藥用價值很高，中醫(yī)應(yīng)用廣泛。醫(yī)學認為核桃性溫、味甘、無毒，有健胃、補血、潤肺、養(yǎng)神等功用。核桃為常規(guī)核桃育種技術(shù)具有局限性，如遠緣雜交困難、有益突變頻率低、選育優(yōu)良品種耗時長、花期不遇等，制約了優(yōu)質(zhì)資源的利用，使得品種選育工作難以取得突破性的進展。而植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有加速育種進程、縮短繁殖時間、改良植物品質(zhì)、節(jié)省空間、減少勞動、可終年生產(chǎn)、不受自然條件限制等特點，可有效解決品種選育耗時長的問題。近年來核桃組織培養(yǎng)研究方面取得了一定的進展，但依然存在一些問題，如外植體褐化現(xiàn)象嚴重、出梢率低、生根困難、移栽大田成活率低等，使組織培養(yǎng)技術(shù)在核桃中的應(yīng)用受到很大的限制。因此，非常有必要建立系統(tǒng)的離體快繁體系，為今后對核桃進行品質(zhì)遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供出一種核桃組織培養(yǎng)再生體系構(gòu)建方法，本發(fā)明以核桃未成熟胚為外植體，經(jīng)過種子消毒、胚愈傷組織誘導、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟構(gòu)建了核桃組織培養(yǎng)再生體系，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明的一種核桃組織培養(yǎng)再生體系構(gòu)建方法，包括以下的步驟：

步驟1，種子消毒：選擇未成熟果子，去葉后于洗衣粉水浸泡42min，刷凈后自來水沖洗2h，取出尚未成熟的乳白或略帶棕色的種子，在超凈工作臺中，剝開外種皮，先用75%乙醇消毒36s后用無菌水洗10次，再用0.1%升汞溶液消毒32min，用無菌水沖洗10次后備用；

步驟2，胚愈傷組織誘導：將經(jīng)步驟（1）處理后未成熟種胚切成0.5cm×0.5cm×0.5cm接種到誘導培養(yǎng)基上,先在25～28℃條件下全暗培養(yǎng)48天，然后置于每天光照16小時，光照強度為3200lx，直至誘導形成胚性愈傷組織；誘導培養(yǎng)基為：ER+6-BA6mg/L+NAA1.5mg/L+GA₃7 mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.2g/L，pH為5.8；

步驟3，分化培養(yǎng)：將步驟（2）培養(yǎng)獲得的呈綠色的子葉愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，接種后先在25～28℃條件下全暗培養(yǎng)18天，然后置于每天光照16小時，光照強度為5600lx，置于培養(yǎng)溫度為25～28℃的條件下培養(yǎng)直至形成叢生芽；分化培養(yǎng)基為：ER+6-BA5.2mg/L+IBA1.5mg/L+蔗糖35g/L+瓊脂7.2g/L，pH為5.8；

步驟4,生根培養(yǎng)：將步驟（3）過程獲得的高度約為4.5cm的叢生芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，接種后先在25～28℃條件下全暗培養(yǎng)15天，然后置于每天光照16小時，光照強度為3500lx，培養(yǎng)溫度為25～28℃的條件下培養(yǎng)至生根；生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA1.2mg/L+GGR2.2mg/L+KT3.2mg/L+蔗糖35g/L+瓊脂7.2g/L，pH為5.8。

步驟5，煉苗移栽：將步驟（4）獲得的高約12cm的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗10天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和粘土混合成的基質(zhì)中并定植于大田中。