[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)丁二酸的代謝工程脫氮假單胞菌、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811442844.6
• 申請(qǐng)日: 2018-11-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109468257A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周生芳;趙梅;張春媚
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/78;C12P7/46;C12R1/38
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 周敏

一種生產(chǎn)丁二酸的代謝工程脫氮假單胞菌、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域和發(fā)酵工程領(lǐng)域，構(gòu)建方法為：將脫氮假單胞菌的基因組DNA中敲除sdhAB基因和/或敲除pta?ackA基因，并將脫氮假單胞菌來(lái)源的乙酰輔酶A合成酶基因acs在脫氮假單胞菌中過(guò)表達(dá)，將上述構(gòu)建的脫氮假單胞菌以乙酸為唯一原料進(jìn)行好氧發(fā)酵得丁二酸。本發(fā)明以乙酸作為原始材料，利用乙酸代謝中間產(chǎn)物乙酰輔酶A生物合成丁二酸，與現(xiàn)有技術(shù)相比，乙酰輔酶A作為代謝中間體，原料來(lái)源更廣泛，成本更低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)丁二酸的代謝工程脫氮假單胞菌、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

丁二酸，一種重要的碳四平臺(tái)化合物，在2004年被美國(guó)能源部確定為最具價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品之一，是合成許多重要中間產(chǎn)物和工業(yè)化學(xué)品的前體，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化學(xué)和農(nóng)業(yè)上。丁二酸還可以作為中間體合成眾多附加應(yīng)用價(jià)值的γ-丁內(nèi)酯、1，4-丁二胺、四氫呋喃等化合物。

在微生物細(xì)胞內(nèi)，丁二酸是TCA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，因此可利用生物質(zhì)原料發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸。目前，微生物生產(chǎn)丁二酸發(fā)酵底物多為可再生資源，如葡萄糖、甘油、木質(zhì)纖維素原料等物質(zhì)。乙酸是一種大量而廉價(jià)的原料碳源，在我國(guó)來(lái)源豐富，主要來(lái)自于合成生物氣轉(zhuǎn)化，甲醇和甲烷轉(zhuǎn)化。木質(zhì)纖維素酸水解中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物也是乙酸，此外，污水污泥厭氧消化等也會(huì)產(chǎn)生大量的乙酸。但是目前尚未有采用脫氮假單胞菌為宿主以乙酸作為唯一碳源直接生物合成丁二酸的報(bào)道。本發(fā)明從增強(qiáng)底物攝取，阻斷下游分解代謝方面對(duì)脫氮假單胞菌進(jìn)行改造，使其能夠直接利用乙酸為碳源生產(chǎn)丁二酸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用乙酸生產(chǎn)丁二酸的代謝工程脫氮假單胞菌的構(gòu)建方法，由上述構(gòu)建方法構(gòu)建的生產(chǎn)丁二酸的代謝工程脫氮假單胞菌工程菌株，及應(yīng)用上述工程菌株菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。

作為本發(fā)明的第一方面，提供了一種生產(chǎn)丁二酸的代謝工程脫氮假單胞菌的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法為下列方法之一：

方法1：將脫氮假單胞菌的基因組DNA中敲除sdhAB基因；

方法2：將脫氮假單胞菌的基因組DNA中敲除sdhAB基因，并將脫氮假單胞菌來(lái)源的乙酰輔酶A合成酶基因acs在脫氮假單胞菌中過(guò)表達(dá)；

方法3：將脫氮假單胞菌的基因組DNA中敲除sdhAB基因和pta-ack基因；

方法4：將脫氮假單胞菌的基因組DNA中敲除sdhAB基因和pta-ack基因，并將脫氮假單胞菌來(lái)源的乙酰輔酶A合成酶基因acs在脫氮假單胞菌中過(guò)表達(dá)。

優(yōu)選的，所述將脫氮假單胞菌來(lái)源的乙酰輔酶A合成酶基因acs在脫氮假單胞菌中過(guò)表達(dá)具體包括：將脫氮假單胞菌來(lái)源的乙酰輔酶A合成酶基因acs構(gòu)建到大腸桿菌-假單胞菌穿梭質(zhì)粒pUCPK上，得到的重組質(zhì)粒pUCPK-acs，然后用pUCPK-acs轉(zhuǎn)化脫氮假單胞菌，得到重組的脫氮假單胞菌。

優(yōu)選的，所述假單胞菌為ATCC13867。

作為本發(fā)明的第二方面，提供了由上述構(gòu)建方法所構(gòu)建的代謝工程脫氮假單胞菌菌株。

作為本發(fā)明的第三方面，提供上述代謝工程脫氮假單胞菌菌株在發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵是以乙酸為原料進(jìn)行好氧發(fā)酵。

優(yōu)選的，所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：100mmol/L磷酸緩沖液、8g/L乙酸鈉、0.25g/L硫酸鎂、1g/L氯化銨、1g/L酵母膏；其中，磷酸緩沖液的pH＝7.0。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明以乙酸作為原始材料，利用乙酸代謝中間產(chǎn)物乙酰輔酶A生物合成丁二酸，與現(xiàn)有技術(shù)相比，乙酰輔酶A作為代謝中間體，原料來(lái)源更廣泛，成本更低。

具體實(shí)施方式：