[發(fā)明專(zhuān)利]不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811439298.0
• 申請(qǐng)日: 2018-11-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109355257B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪登如;汪逸;汪迪飛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 云南研靈生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 北京匯捷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11531
• 代理人: 李宏偉

本發(fā)明提供的不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)方法包括：從哺乳動(dòng)物的脂肪組織、骨髓組織、臍帶組織中分離提純出間充質(zhì)干細(xì)胞，將從脂肪組織中分離提純出的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記為第一間充質(zhì)干細(xì)胞，將從骨髓組織中分離提純出的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記為第二間充質(zhì)干細(xì)胞，將從臍帶組織中分離提純出的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記為第三間充質(zhì)干細(xì)胞；將第一間充質(zhì)干細(xì)胞、第二間充質(zhì)干細(xì)胞、第三間充質(zhì)干細(xì)胞按2:3:1比例混合，進(jìn)行混合培養(yǎng)。采用混合培養(yǎng)時(shí)不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子可以相互促進(jìn)增殖，同時(shí)添加的自體臍帶血血清使得增殖更快，細(xì)胞一致性更好，解決了增殖不一致、增殖緩慢、傳代少、需要多種規(guī)格培養(yǎng)基的問(wèn)題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層、外胚層，屬于多功能干細(xì)胞，具體功能如下：一、具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下具有分化肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的能力。二、具有免疫調(diào)節(jié)功能，通過(guò)細(xì)胞間的相互作用及產(chǎn)生細(xì)胞因子抑制T細(xì)胞的增殖及其免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮免疫重建的功能。三、旁分泌功能，間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)旁分泌分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能促進(jìn)機(jī)體自體干細(xì)胞增殖，血管增生，促進(jìn)前體細(xì)胞遷移，抑制細(xì)胞凋亡，抑制瘢痕產(chǎn)生。四、具有來(lái)源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，不存在免疫排斥的特性。五、低免疫原性，面目模糊，表面抗原不明顯，異體移植排異較輕，配型要求不嚴(yán)格。正是由于間充質(zhì)干細(xì)胞所具備的這些免疫學(xué)特性，使其在臨床疾病治療方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。通過(guò)自體移植可以重建組織器官的結(jié)構(gòu)和功能，并且可避免免疫排斥反應(yīng)。間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)修復(fù)受損組織和器官、改善內(nèi)環(huán)境、提高自身免疫力起著至關(guān)重要的作用。間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，可以用來(lái)修復(fù)受損或病變的組織器官，治療心、腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、骨組織病、角膜損傷、燒傷燙傷、肌病等多種疾病。

單一來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞能在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下分化成幾種或多種成體細(xì)胞，但還是有一定的局限性，如骨髓來(lái)源的間充干細(xì)胞能分化為肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等，卻很難分化為皮膚細(xì)胞、表皮細(xì)胞等，所以單一來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)組織時(shí)存在一定的局限性。不同組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)對(duì)培養(yǎng)基成分要求不同，尤其是各種干細(xì)胞生長(zhǎng)因子添加量和種類(lèi)不同，導(dǎo)致要配置多個(gè)規(guī)格的培養(yǎng)基，擴(kuò)增速度也不同，這些都不利于批量化培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)方法，用以解決不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)難度不一致，擴(kuò)增速度不一致，培養(yǎng)基配方不統(tǒng)一問(wèn)題。

本發(fā)明公開(kāi)的不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)方法，包括：

從哺乳動(dòng)物的脂肪組織、骨髓組織、臍帶組織中分離提純出間充質(zhì)干細(xì)胞，將從脂肪組織中分離提純出的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記為第一間充質(zhì)干細(xì)胞，將從骨髓組織中分離提純出的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記為第二間充質(zhì)干細(xì)胞，將從臍帶組織中分離提純出的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記為第三間充質(zhì)干細(xì)胞；

將從脂肪組織、骨髓組織、臍帶組織中分離提純出的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，具體為：

將第一間充質(zhì)干細(xì)胞、第二間充質(zhì)干細(xì)胞、第三間充質(zhì)干細(xì)胞按2:3:1比例混合，組成P1代混合細(xì)胞；

將P1代混合細(xì)胞以8000-10000個(gè)/cm²接種到培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基，按總體積加入0.1％的D液，搖勻后放入培養(yǎng)箱，在CO₂濃度為5％、濕度為90％、溫度為37℃的環(huán)境中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3天清洗換液一次，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶的80％-90％時(shí)收集細(xì)胞，得到P2代混合細(xì)胞；所述完全培養(yǎng)基為用于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基；所述D液的制備方法為：將臍帶血放入離心管于4-8℃的環(huán)境中靜置3小時(shí)后離心，取淡黃色上清液于4℃的溫度環(huán)境保存?zhèn)溆茫瑯?biāo)記該液為D液；