[發明專利]不同組織來源的間充質干細胞混合培養方法

有效

• 申請號: 201811439298.0
• 申請日: 2018-11-29
• 公開（公告）號: CN109355257B
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發明（設計）人: 汪登如;汪逸;汪迪飛
• 申請（專利權）人: 云南研靈生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 李宏偉

1.不同組織來源的間充質干細胞混合培養方法，其特征在于，包括：

從哺乳動物的脂肪組織、骨髓組織、臍帶組織中分離提純出間充質干細胞，將從脂肪組織中分離提純出的間充質干細胞標記為第一間充質干細胞，將從骨髓組織中分離提純出的間充質干細胞標記為第二間充質干細胞，將從臍帶組織中分離提純出的間充質干細胞標記為第三間充質干細胞；

將從脂肪組織、骨髓組織、臍帶組織中分離提純出的間充質干細胞進行混合培養，具體為：

將第一間充質干細胞、第二間充質干細胞、第三間充質干細胞按2:3:1比例混合，組成P1代混合細胞；

將P1代混合細胞以8000-10000個/cm²接種到培養瓶中，加入完全培養基，按總體積加入0.1％的D液，搖勻后放入培養箱，在CO₂濃度為5％、濕度為90％、溫度為37℃的環境中培養，每天觀察細胞生長情況，每3天清洗換液一次，待細胞鋪滿培養瓶的80％-90％時收集細胞，得到P2代混合細胞；所述完全培養基為用于間充質干細胞培養的無血清培養基；所述D液的制備方法為：將臍帶血放入離心管于4-8℃的環境中靜置3小時后離心，取淡黃色上清液于4℃的溫度環境保存備用，標記該液為D液；

將P2代混合細胞以8000-10000個/cm²接種到培養瓶中，加入完全培養基，按總體積加入0.1％的D液，搖勻后放入培養箱，在CO₂濃度為5％、濕度為90％、溫度為37℃的環境中培養，每天觀察細胞生長情況，每3天清洗換液一次，待細胞鋪滿培養瓶的80％-90％時收集細胞，得到P3代混合細胞；

將P3代混合細胞以8000-10000個/cm²接種到培養瓶中，加入完全培養基后放入培養箱，在CO₂濃度為5％、濕度為90％、溫度為37℃的環境中培養，每天觀察細胞生長情況，每3天清洗換液一次，待細胞鋪滿培養瓶的80％-90％時收集細胞，得到P4代混合細胞；

將P4代混合細胞以8000-10000個/cm²接種到培養瓶中，加入完全培養基后放入培養箱，在CO₂濃度為5％、濕度為90％、溫度為37℃的環境中培養，每天觀察細胞生長情況，每3天清洗換液一次，待細胞鋪滿培養瓶的80％-90％時收集細胞，得到P5代混合細胞，并將P5代混合細胞以1×10⁸個/mL收集凍存；

對P5代混合細胞進行檢測、鑒定，合格的P5代混合細胞即為可用于同源異體移植的間充質干細胞；

從哺乳動物的臍帶組織中分離提純出間充質干細胞的方法為：

取哺乳動物的臍帶，取臍帶時用縫針線系緊兩端，用注射器抽取臍帶血，把臍帶用酒精浸泡3min，用含1％雙抗的PBS清洗3-5遍；將抽出臍帶血的臍帶去兩端，剪成1cm長的臍帶段，用含1％雙抗的PBS清洗3-5遍，直至完全洗凈血細胞，取出臍帶段放在培養皿中加入完全培養基使臍帶保持濕潤，沿臍靜脈剪開，去除臍靜脈壁和兩條臍動脈，取下臍帶外壁內側的華通氏膠，將華通氏膠切成1-2mm³的塊，均勻平鋪于培養瓶中，加入培養所需完全培養量的1/3完全培養基，放入培養箱，在CO₂濃度為5％、濕度為90％、溫度為37℃的環境中培養，24小時后加入另外2/3完全培養基，7天后觀察細胞情況，待有細胞爬出鋪滿培養瓶的20％-30％后清洗換液，每3天清洗換液一次，待細胞鋪滿培養瓶的75％時收集傳代，按6000-8000個/cm²傳代培養，待細胞鋪滿80％-90％時收集得到P1代細胞，標記為第三間充質干細胞。