[發(fā)明專利]一種測定草內(nèi)源激素的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811439296.1
• 申請日: 2018-11-29
• 公開（公告）號: CN109596726A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸欣瑜
• 申請（專利權(quán)）人: 陸欣瑜
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種測定草內(nèi)源激素的方法，包括以下步驟：

先配置0.05M，pH＝7.0磷酸鈉緩沖液，然后再用磷酸緩沖液溶解二乙基二硫代氨基甲酸鈉，具體為100mL磷酸鈉緩沖液溶解0.01～0.1g二乙基二硫代氨基甲酸鈉；

C18固相萃取小柱為CNWBOND LC-C18SPE小柱，500mg/3mL；

(1)選取草地早熟禾和黑麥草，分開提取和檢測，剪取0.3g新鮮葉片，加液氮研磨至粉碎；

(2)加3mL 0.05M，pH＝7.0，含0.02％二乙基二硫代氨基甲酸鈉的磷酸鈉緩沖液：提取液體積mL＝1:10，轉(zhuǎn)移到10mL的離心管中，在4℃下震蕩1h后，用1M鹽酸調(diào)pH至2.6，再加入3mL二氯甲烷，在4℃震蕩1h；

(3)取出離心管，將上個步驟得到的提取物在10000rpm下離心10min，取下清液約3mL轉(zhuǎn)移至另一離心管中；殘?jiān)偌尤?mL二氯甲烷，在4℃下繼續(xù)震蕩1h，10000rpm下離心10min，合并下清液；

(4)用氮?dú)獯蹈啥燃淄椋缓笥?mL濃度80％甲醇溶解，渦旋5min后，利用C18固相萃取小柱進(jìn)行脫色脫脂：先用5mL甲醇活化C18固相萃取小柱，再用5mL濃度80％甲醇平衡；然后再上草坪草內(nèi)源激素待測樣品，最后用1mL濃度80％甲醇洗脫，共收集2mL洗脫液，35℃真空抽干；

(5)用400μL甲醇/0.075％乙酸溶液，V/V＝1:1的混合溶液溶解；渦旋3min；然后過0.45μm濾膜，轉(zhuǎn)移至色譜瓶中；

(6)利用安捷倫1260高效液相色譜儀對脫色脫脂后的草坪草內(nèi)源激素樣品進(jìn)行測定，其色譜條件為：

色譜柱為Agilent C18反相柱5μm,4.6mm×25cm；流動相為甲醇∶0.075％的乙酸；流速為1mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10μL；檢測波長：ABA為262nm，IAA為280nm；以標(biāo)樣出峰時間和峰高疊加定性，外標(biāo)法峰面積定量，

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：

取適量母液，用甲醇：0.075％的冰乙酸＝1:1作為溶劑，配制成濃度梯度為：0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.6μg/mL、3.2μg/mL的標(biāo)樣系列溶液，然后進(jìn)行HPLC測定，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而建立起激素濃度和峰面積大小之間的函數(shù)關(guān)系；激素標(biāo)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：YIAA＝0.0498X+0.0215，R2＝0.9998；YABA＝0.0138X-0.0026，R2＝0.9998；其中X為HPLC圖譜上的峰面積；Y為樣品激素濃度μg/mL；

回收率的測定：

采用添加標(biāo)樣法測定回收率：取同一盆草坪草葉片樣品3份，在研磨時第1份不加激素標(biāo)樣；第2份加入IAA和ABA標(biāo)樣；第3份在步驟(5)中加入IAA和ABA標(biāo)樣，使其標(biāo)樣激素含量與第2份的理論含量相等，按提取步驟平行操作，并在相同的色譜條件下分別進(jìn)樣，三份樣品的色譜圖均出現(xiàn)與標(biāo)樣相同保留時間的激素吸收峰；有標(biāo)樣的樣品上HPLC儀后，在這些激素的保留時間處色譜峰高和峰面積均增大，說明樣品內(nèi)源激素和添加的激素標(biāo)樣疊加出峰，回收率＝(第3份的峰面積-第1份的峰面積)/(第2份的峰面積-第1份的峰面積)*100％，重復(fù)5次，所得結(jié)果為：IAA的平均回收率為95％，ABA的平均回收率為90％。