[發明專利]檢測加熱不燃燒卷煙總粒相物對細胞炎癥因子分泌量影響方法

在審

• 申請號: 201811433473.5
• 申請日: 2018-11-28
• 公開（公告）號: CN109580957A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 管瑩;李雪梅;徐玉瓊;湯建國;朱東來;張霞;韓敬美;何東沅;張偉;高茜
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12Q1/02
• 代理公司: 北京市領專知識產權代理有限公司 11590
• 代理人: 任文娟;陳有業

1.檢測加熱不燃燒卷煙總粒相物對細胞炎癥因子分泌量影響方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)樣品前處理：采用直線型吸煙機，在抽吸容量為55.0mL，持續時間3s，抽吸頻率為30s的抽吸條件下，連續抽吸10口，用直徑為44mm的劍橋濾片捕集，分別于抽吸前、抽吸后稱量煙氣捕集器的質量，按照公式(1)計算加熱不燃燒卷煙總粒相物的質量mTPM；

mTPM＝m₁-m₀ (1)

式中：

m₀——抽吸前煙氣捕集器的質量，單位為毫克(mg)；

m₁——抽吸后煙氣捕集器的質量，單位為毫克(mg)；

捕集完畢后，將捕集后的劍橋濾片放入50mL的三角瓶中，加入二甲基亞砜，使加熱不燃燒卷煙總粒相物在二甲基亞砜中的濃度為40mg/mL；將此三角瓶置于超聲儀上超聲30min；再用無菌濾紙過濾收集二甲基亞砜萃取液，分裝至1mL的凍存管中，-80℃保存待用；

(2)人鼻腔上皮細胞單細胞懸浮液的制備：人鼻腔上皮細胞RPMI2650復蘇后，接種到25cm²細胞培養瓶中，加入10mLRPMI1640細胞培養基，置于37℃、5％CO₂培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察培養細胞的匯合和形態情況，待細胞長至70％～90％的匯合率時，移除培養瓶中的RPMI1640細胞培養基，用磷酸緩沖液洗兩次，棄洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液單層孵育1～2min，用RPMI1640細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；

(3)人鼻腔上皮細胞單細胞懸浮液的細胞濃度計算：用血球計數板計數法對步驟(2)所得人鼻腔上皮細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，得到每毫升單細胞懸浮液的活細胞數；

(4)人鼻腔上皮細胞單細胞懸浮液的接種：將步驟(3)計數后的人鼻腔上皮細胞單細胞懸浮液用RPMI1640細胞培養基稀釋至2.0×10⁵個/mL，再按接種量為1mL/孔接種到12孔細胞培養板中，然后將12孔細胞培養板置于37℃、5％CO₂培養箱內培養24h；

(5)受試物暴露：把步驟(1)中制備的樣品用PBS稀釋成400μg/mL的工作液備用，取出12孔細胞培養板，去除細胞培養液，將不同劑量的待測液加入細胞培養板中，每個劑量設3個復孔，置于37℃，5％CO₂培養箱中培養24h；

(6)受試物孵育品的收集：培養完成后，分別收集12孔細胞培養板每孔中的上清液，1000rpm離心20min，然后用1.5mL離心管分別收集各孔的離心后上清液備用；

(7)標準溶液配制：梯度稀釋法配制炎癥效應因子的標準曲線溶液；

(8)加樣：取96孔酶標板，在空白對照孔中加PBS磷酸鹽緩沖液100μL，其余孔分別加標準曲線溶液和備用的離心后上清液各100μL，酶標板覆膜，37℃，孵育90分鐘；

(9)加入抗體：加樣孵育完成后，取出96孔酶標板，棄液，甩干，每孔加入抗體工作液100μL，蓋酶標板覆膜，37℃，孵育60分鐘；

(10)洗板、加酶：加抗體孵育完成后，取出96孔酶標板，棄液，甩干，加入清洗液350μL/每孔，浸泡2分鐘，棄液，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干；重復洗板3次；然后在每孔中加酶結合工作液100μL，蓋酶標板覆膜，37℃孵育30分鐘；

(11)洗板、顯色：加酶孵育完成后，取出96孔酶標板，棄液，甩干，加入清洗液350μL/每孔，浸泡2分鐘，棄液，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干；重復洗板5次；然后在每孔中加底物工作液90μL，蓋酶標板覆膜，37℃孵育，30min后加入終止液50μL/孔；

(12)測量吸光值：在酶標儀450nm下檢測吸光度；

(13)細胞炎癥因子分泌量測定：根據標準溶液吸光度值繪制標準曲線，計算樣品的細胞炎癥因子分泌量。