[發(fā)明專(zhuān)利]一種妊娠特異性糖蛋白3的兔多克隆抗體的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811433190.0
• 申請(qǐng)日: 2018-11-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109575131A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魯江徽;劉峰;謝龍生
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 必歐瀚生物技術(shù)（合肥）有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/18
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/18
• 代理公司: 合肥天明專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 34115
• 代理人: 趙瑜;金凱

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種妊娠特異性糖蛋白3的兔多克隆抗體的制備方法，將重組表達(dá)PSG3的原核表達(dá)重組菌發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過(guò)純化后得到高純度的PSG3重組蛋白，用該蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔得到免疫血清，再將抗血清親和層析純化獲得高純度的PSG3兔多克隆抗體。所純化的抗體經(jīng)SDS?PAGE鑒定純度大于95%，抗血清和純化后多抗效價(jià)均大于1:10⁶，抗體無(wú)菌過(guò)濾后存放于2?8℃可長(zhǎng)期保存，室溫下可保存2年。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種妊娠特異性糖蛋白3的兔多克隆抗體的制備方法。

背景技術(shù)

妊娠特異性糖蛋白(Pregnancy Specific Glycoprotein，PSG)是一種胎盤(pán)多肽，自1971年德國(guó)科學(xué)家Bohn從人胎盤(pán)中分離提純出來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了廣泛的研究。發(fā)現(xiàn)PSG與早孕并發(fā)癥、宮內(nèi)胎兒生長(zhǎng)狀況及消化道腫瘤疾病關(guān)系密切，對(duì)臨床上相關(guān)疾病的診斷具有指示作用。日本學(xué)者報(bào)道妊娠特異性糖蛋白1(Pregnancy SpecificGlycoprotein 1，PSG1)可在子宮頸癌，子宮體癌，卵巢癌，乳腺癌，淋巴瘤和胃腸道惡性腫瘤患者的血中檢測(cè)，進(jìn)一步研究證實(shí)癌細(xì)胞漿中存在有PSG1的患者比沒(méi)有PSG1患者存活時(shí)間短。近年來(lái)對(duì)妊娠特異性糖蛋白3(Pregnancy Specific Glycoprotein 3，PSG3)的研究受到廣泛關(guān)注。PSG3是癌胚抗原(CEA)家族的成員，PSG3蛋白全長(zhǎng)428個(gè)氨基酸，在胚胎發(fā)育的過(guò)程中同胚胎期免疫耐受的建立以及血管生成有關(guān)，同時(shí)該指標(biāo)可應(yīng)用于消化道腫瘤的診斷。

目前市場(chǎng)上還沒(méi)有PSG3相關(guān)體外診斷試劑盒，更沒(méi)有效價(jià)達(dá)到1:10⁶的PSG3相關(guān)體外診斷試劑盒。而目前已查閱的關(guān)于抗體制備的相關(guān)文獻(xiàn)中多抗的效價(jià)大部分低于1：10⁶，且此抗體效價(jià)的判斷依據(jù)是：若待測(cè)孔OD＞0.1，且大于陰性對(duì)照孔的2.1倍(P/N＞2.1，其中P待測(cè)血清在某一稀釋倍數(shù)測(cè)定的OD值，N為陰性血清在相應(yīng)稀釋倍數(shù)時(shí)測(cè)定的OD值)，判定為陽(yáng)性，以判定為陽(yáng)性的血清最高稀釋倍數(shù)為血清抗體效價(jià)。本發(fā)明制備的PSG3多抗為了以后PSG3診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)墊下基礎(chǔ)，抗體在用作診斷試劑盒開(kāi)發(fā)的的原材料時(shí)，效價(jià)越高越好，抗體效價(jià)越高可使試劑盒檢測(cè)結(jié)果越準(zhǔn)確，同時(shí)也可在一定范圍內(nèi)節(jié)省成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種妊娠特異性糖蛋白3的兔多克隆抗體的制備方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種妊娠特異性糖蛋白3的兔多克隆抗體的制備方法，以PSG3重組蛋白作為免疫原免疫兔子獲得抗血清，再將血清經(jīng)過(guò)親和層析純化獲得高純度的多抗，所述的免疫共4次，包括初次免疫和3次加強(qiáng)免疫，所述初次免疫為將PSG3重組抗原和弗氏完全佐劑1:1乳化后進(jìn)行免疫，所述加強(qiáng)免疫為將PSG3重組抗原和弗氏不完全佐劑1:1乳化后進(jìn)行免疫。

優(yōu)選地，所述初次免疫和/或加強(qiáng)免疫時(shí)所取的PSG3重組抗原的量為1.5-3mg。

優(yōu)選地，所述初次免疫和/或前兩次加強(qiáng)免疫的注射方式為兔子背部多點(diǎn)皮下注射。

優(yōu)選地，所述第三次加強(qiáng)免疫的注射方式為兔子耳緣靜脈注射。

優(yōu)選地，所述初次免疫和/或加強(qiáng)免疫時(shí)注射的計(jì)量為0.3-0.8mL。

優(yōu)選地，所述4次免疫的每次免疫間隔時(shí)間為8-12天。

優(yōu)選地，所述免疫的兔子為新西蘭大白兔，雌性，初次免疫時(shí)體重在1.5-2.0kg。

優(yōu)選地，所述乳化為完全乳化，乳化后的抗原滴在冷水上經(jīng)久不散。

優(yōu)選地，所述抗血清的獲取步驟為，對(duì)免疫完成的兔子進(jìn)行心臟取血，將全血在37℃條件下靜置1h，再置于2-8℃條件下靜置過(guò)夜，吸取上清即為兔抗血清，全程無(wú)菌操作。