[發(fā)明專利]一種脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811431804.1
• 申請日: 2018-11-27
• 公開（公告）號: CN109355256A
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 柴勛;楊娟;吳國祥
• 申請（專利權(quán)）人: 上?？漆t(yī)聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/077
• 代理公司: 寧波鄞州全方專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 33242
• 代理人: 樓瑜舟;劉永斌

本發(fā)明其中一種技術(shù)方案提供了一種脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該方法中使用滅活的成纖維細(xì)胞進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。本發(fā)明使用滅活的成纖維細(xì)胞能釋放凋亡信號，抑制成纖維細(xì)胞的擴(kuò)增，且不影響脂肪干細(xì)胞的擴(kuò)增；滅活的成纖維細(xì)胞能釋放各種因子如bfgf、igf?1，TGF等，所以用該細(xì)胞當(dāng)滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞不需要額外再添加因子，只需用基礎(chǔ)培養(yǎng)基加血清替代物即可，且其擴(kuò)增效率是傳統(tǒng)方法的一倍以上。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及脂肪干細(xì)胞。

背景技術(shù)

脂肪干細(xì)胞來源于皮下脂肪，而皮下脂肪中包裹著豐富的結(jié)締組織?，F(xiàn)有的方法并不能完全分離脂肪和結(jié)締組織，甚至還有一部分真皮層殘留。

結(jié)締組織和真皮中富含成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞，也稱為纖維母細(xì)胞，是疏松結(jié)締組織中主要的細(xì)胞，屬于終末分化細(xì)胞。成纖維細(xì)胞體外擴(kuò)增能力極強(qiáng)，生長速度快，環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)，只要有一點殘留就常會污染多種細(xì)胞培養(yǎng)，如表皮細(xì)胞培養(yǎng)、黑色素細(xì)胞培養(yǎng)等，這些細(xì)胞培養(yǎng)中一旦有了成纖維細(xì)胞污染，便難以除去從而導(dǎo)致實驗失敗。在脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，由于成纖維細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，表型表征等與干細(xì)胞幾乎一樣，往往成纖維細(xì)胞污染被忽視。更糟糕的是，根據(jù)國內(nèi)外現(xiàn)有對脂肪干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，并無法區(qū)分這2種細(xì)胞，很多科研工作者養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞已經(jīng)全部都是成纖維細(xì)胞還不自知。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，并不能抑制成纖維細(xì)胞的生長，反而在傳統(tǒng)的培養(yǎng)條件下，成纖維細(xì)胞對比脂肪干細(xì)胞有生長優(yōu)勢。成纖維細(xì)胞污染，會導(dǎo)致脂肪干細(xì)胞純度越來越低，無論下端進(jìn)行實驗還是臨床都不能正確評價脂肪干細(xì)胞的效果，從而導(dǎo)致實驗誤差，臨床上有明顯的副反應(yīng)等。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述現(xiàn)有方法的不足，本發(fā)明開發(fā)了新的脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，及滅活的成纖維細(xì)胞的新用途。

本發(fā)明其中一種技術(shù)方案提供了一種脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該方法中使用滅活的成纖維細(xì)胞進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。

本發(fā)明其中另一種技術(shù)方案提供了一種脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，滅活的成纖維細(xì)胞的制備方法為使用絲鏈霉素滅活。

本發(fā)明其中另一種技術(shù)方案提供了一種脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，上述脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法步驟如下：

步驟a：消化脂肪；

步驟b：分離出經(jīng)所述步驟a消化后的混合細(xì)胞，并對剩余的疏松結(jié)締組織進(jìn)行消化得到滅活的成纖維細(xì)胞；

步驟c：對所述混合細(xì)胞進(jìn)行選擇性培養(yǎng)得到脂肪干細(xì)胞，所述選擇性培養(yǎng)的方法為在所述混合細(xì)胞中按比例添加所述滅活的成纖維細(xì)胞。

本發(fā)明其中另一種技術(shù)方案提供了一種脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，所述脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法中使用的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基L-DMEM+血清替代物。血清替代物可選的其中一種為EliteGro-Advanced。

本發(fā)明其中另一種技術(shù)方案提供了一種脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，上述比例為5：1。

本發(fā)明其中另一種技術(shù)方案提供了一種脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，上述脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)方法步驟如下：

步驟1、取自體脂肪組織；

步驟2、放于無菌平皿中，用含有抗生素的生理鹽水沖去表面血液；

步驟3、取出經(jīng)步驟2的脂肪組織，放入平皿中，用手術(shù)刀剪碎；

步驟4、將經(jīng)步驟3的脂肪組織轉(zhuǎn)入離心管中，用DPBS洗滌，直至洗滌液澄清；

步驟5、加入等脂肪組織體積消化液NB4G(德國SERVA膠原酶NB4G)；

步驟6、37℃恒溫震蕩30到80min；

步驟7、離心1500rpm/5min，此時細(xì)胞分3層：油脂、消化液及沉淀；