[發(fā)明專利]植物乳桿菌菌株的鑒定方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811427912.1
• 申請日: 2018-11-27
• 公開（公告）號: CN109266771A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張紅發(fā);劉振民;游春蘋;扶曉菲
• 申請（專利權(quán)）人: 光明乳業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12R1/25
• 代理公司: 北京東正專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11312
• 代理人: 蔡仲德

本發(fā)明提供了一種植物乳桿菌菌株的鑒定方法。該方法包括以下步驟：(1)提取待測菌株基因組DNA，雙酶切基因組DNA，得到酶切后的基因片段；(2)選取pMD18?T質(zhì)粒載體，雙酶切后，得到酶切后的質(zhì)粒；(3)將酶切后的基因片段與酶切后的質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化，克隆，測序，獲得至少7條序列；(4)將獲得的序列進行BLAST比對分析，每條序列對應(yīng)多個同源性高的菌株，如果任意7條序列對應(yīng)的共有菌株僅為植物乳桿菌，就鑒定待測菌株為植物乳桿菌菌株。本發(fā)明提供了一種全新的鑒定植物乳桿菌菌株的方法。本發(fā)明的方法操作簡單、特異性強，費用低，時間短，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物乳桿菌菌株的鑒定方法。

背景技術(shù)

微生物研究中經(jīng)常要進行菌種鑒定，而自然界大部分微生物都難以純化培養(yǎng)，因此非培養(yǎng)的測序鑒定方法有很大優(yōu)勢。常用的測序鑒定方法難以區(qū)分菌株。全基因組測序可以鑒定區(qū)分特定菌株，但周期長，費用高。因此需要發(fā)展一種特異的菌株測序鑒定方法，提高鑒定分辨率，降低檢測費用。

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum subsp)具有調(diào)節(jié)人體腸道菌群、降血脂、降膽固醇等益生功能，但不是所用菌株都有益生功能。植物乳桿菌ST-III是乳桿菌中一種典型的菌株，自身具有降低膽固醇、降血脂、提高人體免疫力等多種益生功能。植物乳桿菌ST-III的基因組已于2010年測定并公布，同時該菌株已經(jīng)作為發(fā)酵劑應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，但目前市場相對混亂，存在大量以假亂真、以次充好的現(xiàn)象。

因此，研究一種簡單、快速鑒定植物乳桿菌菌株的方法，具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種簡單、快速鑒定植物乳桿菌菌株的方法，該方法僅使用幾條序列就能鑒定出植物乳桿菌菌株。

具體的，一方面，本發(fā)明提供了一種植物乳桿菌菌株的鑒定方法，該方法包括以下步驟：

(1)提取待測菌株基因組DNA，雙酶切基因組DNA，得到酶切后的基因片段；

(2)選取pMD18-T質(zhì)粒載體，雙酶切后，得到酶切后的質(zhì)粒；

(3)將酶切后的基因片段與酶切后的質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化，克隆，測序，獲得至少7條序列；

(4)將獲得的序列進行BLAST比對分析，每條序列對應(yīng)多個同源性高的菌株，如果任意7條序列對應(yīng)的共有菌株僅為植物乳桿菌，就鑒定待測菌株為植物乳桿菌菌株。

本發(fā)明通過雙酶切待測菌株的基因組和載體質(zhì)粒，連接，轉(zhuǎn)化，克隆測序后進行比對分析，如果7條序列對應(yīng)的共有菌株為植物乳桿菌菌株，就鑒定為植物乳桿菌菌株。本發(fā)明可以僅利用任意7條常用序列，就能將植物乳桿菌菌株鑒定出，操作簡單，費用低。

進一步的，步驟(1)中，將待測菌株劃線培養(yǎng)后獲得單菌落，挑取單菌落經(jīng)純培養(yǎng)離心收集菌體，液氮粉碎菌體后提取基因組DNA。

進一步的，步驟(1)中，雙酶切所用的酶為Pst I內(nèi)切酶和BamH內(nèi)切酶。

進一步的，步驟(1)中，雙酶切后，將酶滅活，然后過柱純化。

進一步的，步驟(2)中，在氨芐抗性LB平板上，挑取載體pMD18-T自連質(zhì)粒，然后進行液體擴培。

進一步的，步驟(2)中，使用依賴于ATP的線性DNA分解酶純化質(zhì)粒。

進一步的，步驟(3)中，酶切后的基因片段與酶切后的質(zhì)粒使用T4 DNA連接酶進行連接。

進一步的，步驟(3)中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，使用氨芐青霉素進行抗性篩選。

進一步的，步驟(3)中，將轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，將鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子送樣測序。